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522024届贵阳护理职业学院学生毕业论文III中文摘要目的:研究noggin、骨形态发生蛋白2〔icprotein2,BMP2〕、胰岛素样生长因子I〔insulinlikegrowthfactorI,IGF-I〕对成骨细胞增殖和分化的调节作用。方法:1、将人成骨肉瘤细胞MG63于RPMI1640培养基中培养,添加不同浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白进行药物干预,用四***偶氮唑盐〔methylthiazolyl-tetrazolium,MTT〕法研究细胞的增殖率。2、选用最适浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白作用成骨细胞,运用ELISA方法和RT-PCR技术分别检测成骨细胞分化标志物骨碱性磷酸酶〔bonealkalinephosphatase,BALP〕和骨钙蛋白〔osteocalcin,OC〕的蛋白含量和mRNA的表达情况。结果:1、各药物干预组OD值与对照组相比有统计学差异〔P<〕,对成骨细胞增殖的作用效应呈剂量和时间依赖性,其作用的最正确时间均在72h。各药物组内之间比较,确定了最正确作用浓度,BMP2为2×10-9mol/L,℅;noggin为8×10-9mol/L,℅;IGF-I为1×10-8mol/L,℅。结论:BMP2、IGF-I对MG63细胞增殖有促进作用,而noggin那么抑制MG63细胞的增殖。Noggin、BMP2和IGF-I促进BALP的分泌。Noggin对OC蛋白的分泌有抑制作用,而BMP2、IGF-I那么促进OC蛋白的分泌。关键词:Noggin蛋白,BMP2蛋白,IGF-I蛋白,成骨细胞,增值,分化2024届贵阳护理职业学院学生毕业论文V英文摘要Object:Theaimsistostudytheeffectsofnoggin,icprotein2(BMP2)andinsulin-likegrowthfactorI(IGF-I):acelllineMG63werechosenusingtheRPMI1640mediumwith10℅fetalbovineserum(FBS).Then,theculturedMG63cellswereexposedtoBMP2,nogginandIGF-Iatdifferentconcentrationswithzeroconcentrationascontrolgroup(CON).AbilityoftheproliferationofMG63cellswasdetectedbymethylthiazolyltetrazoliummethod(MTT).(12h,24h,48h,72h)afteroptimaldosageofnogginBMP2,IGF-:,nogginandIGF-paredwiththatofCONgroup(P<).TheeffectsofthreefactorsonMG63cellwasdose-dependentlyandtime-×10-9mol/℅and1×10-8mol/LofIGF-℅,while8×10-9mol/℅,,nogginandIGF-paredwiththatofCONgroup(P<)for48h,especially,thenoggingroupwasextremelysignificant(P<),andtheBALPmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent(P<).(P<)for24h,buttheOCmRNAexpressionwerenotsignificantlydifferent(P>).paredwiththatofCONgroup2024届贵阳护理职业学院学生毕业论文VparedwiththatofCONgroup(P<),andtheOCmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent(P<).TheconcentrationofOCofIGF-paredwiththatofCONgroup(P<),andtheOCmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent(P<).Conclusion:BMP2andIGF-,BMP2,andIGF--IimprovedtheconcentrationofOCinosteoblasts,:Noggin;icprotein2(BMP2);insulin-likegrowthfactorI(IGF-I);MG63cell;proliferation;,其主要表现在体高体长的增长方面。而体高体长的增长那么源于骨骼的纵向生长,从而形成相应的骨骼系统,到达体高体长的增长的目的。骨骼系统也是机体非常重要的一个组成局部,它支撑躯体,保护内脏,并且和骨骼肌一起协调配合完成其运动功能。在骨骼的生长发育过程中,骨组织不断进行着新骨形成和旧骨吸收的骨重建过程,即骨形成〔boneformation〕与骨吸收〔boneresorption〕的动态平衡代谢过程。骨形成由成骨细胞介导来完成。在骨形成过程中,成骨细胞主要经历细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和细胞凋亡四个阶段。在幼年生长时期,骨形成远远大于骨吸收〔KrupaBetal,2024〕,为骨骼的生长提供了良好的根底,也为体高体长的增长提供了重要的保证。在成年时期,骨的形成较为稳定,骨骼的生长不再发生变化,这主要是受到骨形成与骨吸收相对均衡的一个动态调节作用来完成。在晚年时期,那么主要趋向于骨吸收大于骨形成,从而骨形成会受到一定的影响,这将导致一系列骨疾病的发生,比方在老年人群体中常出现的骨质疏松症。然而骨骼的纵向生长是一种十分复杂的过程,是多种内分泌激素、生长因子在时空上对生长板综合作用的结果。内分泌系统的全身性激素如生长激素、降钙素、甲状旁腺激素、性激素、糖皮质激素等,与生长因子如胰岛素样生长因子-〔Iinsulin-likegrowthfactor-I,IGF-I〕、骨形态发生蛋白(icproteins,BMPs)、转化生长因子(transforminggrowthfactorTGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactors,FGF)、血管内皮生长因子〔vascularendothelialgrowthfactor,VEGF〕、甲状旁腺素相关肽〔PTH-relatedpeptide,PTHrP〕等局部因子,以及外源性物质如维生素D等相结合,共同调节骨骼生长过程。(一级标题)〔二级标题〕在1965年,Urist首次发现骨形成蛋白(icprotein,BMP),BMP属于转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β)超家族的一员,具有诱导骨形成的作用,现已发现其家族至少有20多个成员。BMP是一种低分子量酸性多肽,属于二硫健交联的生长和分化因子〔WozneyJM等,1998〕。是结构类似的高度保守的功能蛋白质族,其C-端有一个高度保守的结构域,内含7个位置稳定的半肤氨酸,这对于形成正确的二聚体结构有重要意义。研究发现,BMP的活性形式为二聚体,它既可以两个相同的链形成的同源二聚体起作用,也可以两个不同的链形成的异源二聚体起作用。BMP合成时是一个大的前体蛋白,包括一个信号肤局部,一个前结构域及一个羧基末端区。当羧基末端区经蛋白水解酶作用从前体蛋白上释放出来时,二聚体即开始形成,它释放到细胞外与机体各处靶细胞外表的相应受体结合而发挥作用。BMP家族成员都通过结合两种丝氨酸/苏氨酸激酶跨膜受体〔即BMPⅠ型和Ⅱ型受体〕发挥其生物学活性功能〔MiyazonoKetal,2001〕。研究发现,BMP之间可与不同的受体结合,表现信号传递的多样性。正是同一种BMP可结合几种不同的Ⅰ型受体,所以才表现出具有调节细胞趋化、增生、分化、迁移和凋亡等多种功能〔MehlerMFetal,1997〕。例如,BMP与适宜的受体结合,能够在体内、体外诱导未分化的间充质细胞向软骨、骨细胞发生不可逆的分化,形成软骨和骨组织〔BarbozaEetal,1999〕。〔二级标题〕BMPs是由多组单位构成的复合物。据研究报道,能够对成骨前体细胞MSCs的成骨分化作用主要有BMP2、6、9三种BMP蛋白,而其它的BMP那么对成熟的成骨细胞的有作用,其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子〔WozneyJMetal,1998〕。研究发现BMP作为一种强骨诱导活性的生长因子,能够启动MSCs的成骨过程〔WuXetal,1996〕。BMP对MSCs分化促进作用,主要是增加细胞内BALP活性,提高胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥素的表达。这可能是因为MSCs中有较多的未分化细胞,BMP与该细胞膜外表特异的膜受体结合2024届贵阳护理职业学院学生毕业论文8,通过信号转导途径,激活细胞相应基因表达促进成骨作用的蛋白。Gazze研究发现BMP降低细胞内的胶原酶mRNA的表达,利于细胞外基质的合成〔GazzerroEetal,1999〕。跨膜丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶是BMP的受体,BMP的诱导机制控制着成骨过程的趋化、有丝分裂及分化三个关键步骤〔ReddiAHetal,1995〕。骨诱导是指一种组织或其产物能使第二种组织分化成骨的过程。诱导成骨需具备三个条件〔StoneCA等,1997;ReddiAH等,2000〕:〔l〕存在诱导因子,当某些部位BMP浓度到达一定程度,就可以诱导骨生成。〔2〕存在BMP的靶细胞群,即骨髓中存在诱导性成骨细胞〔IOPC〕和定向性成骨细胞〔DOPC〕〔ReddiAHetal,1995〕,前者需要分子信号诱导分化,而后者可以自行分化为成骨细胞。诱导性成骨细胞是作为BMP靶细胞。体外研究说明BMP靶细胞还有:结缔组织中未分化而有活力的间充质细胞、骨膜基质细胞、骨膜细胞〔BostromMPetal,1993;***Petal,2000〕。〔3〕存在允许骨生长的正常环境。BMP诱导成骨包含有3阶段,每一阶段都具有多分子放大效应〔ReddiAHetal,2000〕:〔1〕诱导趋化,是指细胞响应化学信号分子浓度变化所做出的方向性移行,在BMP趋化作用下,血浆纤维连接蛋白与产胶原的骨基质连接,促进间充质细胞黏附其上发生增殖。天然牛BMP3和BMP4在体外可以直接趋化血中单核细胞〔ReddiAHetal,1995〕。趋化性与BMP浓度及细胞上的受体密度有关;〔2〕诱导有丝分裂,细胞通过有丝分裂得到增殖;〔3〕诱导分化,BMP可以诱导成纤维型细胞分化为成骨型细胞。BMP在诱导软骨化骨时伴有I型胶原和II型胶原,碱性磷酸酶基因表达。〔一级标题〕〔二级标题〕〔三级标题〕在1992年,California大学的Harland,,,在人的体内定位于染色体17q22,在大鼠与小鼠体内定位于11号染色体。NoggincDNA编码产物为26kD的蛋白,具有疏水氨基末端,是一种分泌蛋白。Noggin基因编码的蛋白序列具有高度的保守性,人类noggin的氨基酸序列与2024届贵阳护理职业学院学生毕业论文9爪蟾、小鼠、大鼠、兔子、马具有高度的同源性。它对胚胎和个体发育有着重要的作用,如神经管的形成和关节软骨的形成。结果实验采用MTT法主要基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解,产生紫兰色结晶状颗粒,其量与活细胞数呈正比,也与细胞的活力呈正比,因此本文应用MTT法测定MG63细胞增殖活性的变化。运用外源BMP2蛋白干预MG63细胞的增殖,结果显示,BMP2蛋白能够直接促进MG63细胞的增殖,呈表现出剂量和时间依赖性,浓度为2×10-9mol/L作用72h时增殖率最高,℅。与本文的研究结果不同,其他学者的研究结果〔KuoPLetal,2024〕显示,100ng/ml的BMP2作用48h对MG63细胞没有增殖作用,显然本文使用的有效浓度更低。在体外,外源BMP2直接刺激成骨细胞的形成和成熟,是成骨细胞增殖、分化和形成的有效促进物。研究证实〔王军琳等,2024〕,外源BMP2蛋白能够显著诱导周期蛋白CDK4表达的增加,促进细胞的增殖。因为细胞周期蛋白D在细胞G1期进程中控制着G1期的时间,CDK4〔或CDK6〕作为催化亚基与其结合形成复合物构成全酶发挥作用,促使细胞越过限制点,完成G1期向S期时相的转换。成纤维细胞中cyclinD1过度表达导致G1期缩短,提前进入S期,细胞体积小并丧失对外源性增殖分裂信号的响应。CyclinD1和CDK4在肿瘤细胞的细胞周期循环中出现障碍时,CyclinD1表达产物的堆积将使肿瘤细胞的G1期缩短,引起细胞的过度增殖〔SherrCJ,1996〕。外源性noggin蛋白对MG63细胞的增殖具有明显的抑制作用,并存在明显的时间和浓度依赖性,浓度为8×10-9mol/℅。应用浓度为1μg/ml时noggin〔康健等,2024〕,%,相比之下,本文应用的noggin有效浓度更低,之间的差异可能与胎牛血清中的干扰因子有关。在培养基中添加胎牛血清的同时也将其中的BMPs等因子带入〔马忠仁等,2024;李巍等,2024〕,可能会对noggin蛋白的作用造成一定的干扰。noggin对细胞增殖的抑制作用,主要通过抑制BMPs实现的。N2024届贵阳护理职业学院学生毕业论文10