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用线粒体D-loop和Cytb基因序列分析拉氏3个群体的遗传结构和遗传分化.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。用线粒体D-loop和Cytb基因序列分析拉氏3个群体的遗传结构和遗传分化??杨培民,胡宗云,金广海,刘义新,王雷,骆小年(辽宁省淡水水产科学研究院,辽宁省水生动物病害防治重点实验室,辽宁辽阳111000)杨培民,胡宗云,金广海,刘义新,王雷,骆小年(辽宁省淡水水产科学研究院,辽宁省水生动物病害防治重点实验室,辽宁辽阳111000)用线粒体DNA的D-loop和Cytb基因序列分析方法研究了吉林延吉、敦化和辽宁法台3个区域的29尾拉氏PhoxinuslagowskiiDybowsky的遗传多样性。经PCR扩增和测序,获得了783~785bpD-loop和818bpCytb的同源序列。两者多态性遗传参数统计显示,29尾个体分别存在47(D-loop)和89(Cytb)个变异位点,分别检测出15(D-loop)和11(Cytb)个单倍型,总群体单倍型(Hd)(D-loop)(Cytb),核苷酸多样性指数(P)(D-loop)(Cytb),平均核苷酸差异数(K)(D-loop)(Cytb)。分子方差分析(AMOVA)结果表明,%(D-loop)%(Cytb)变异来自群体间,%(D-loop)%(Cytb)来自群体内。单倍型呈明显的地理差异,分成2个分支,一个以延吉群体为主,一个以法台群体为主。拉氏的遗传多样性水平较高,群体间遗传分化明显。该结果可为拉氏的种质资源保护提供参考。拉氏;D-loop;Cytb;遗传多样性;遗传分化线粒体DNA(mtDNA)具有母性遗传、进化速度快、核苷酸替代率高的特点,是研究鱼类进化生物学和群体遗传的重要遗传标记[11,12]。在mtDNA上,D-loop属非编码区,是整个mtDNA上进化速度最快的区域,常用于研究群体遗传[12]。Cytb基因是mtDNA上结构和功能解析最为透彻的蛋白质编码基因之一,进化速度适中,适于检测种群水平差异,亦用于研究种间和种内遗传分化[13,14]。本研究对拉氏线粒体D-loop序列和Cytb基因进行PCR扩增、测定和比对分析,旨在为了解东北地区3个拉氏野生群体遗传多样性水平和群体间遗传分化程度,为保护拉氏资源提供遗传背景依据。,采用地笼网采集了3个水系29尾野生拉氏样本,其中敦化群体8尾(牡丹江水系,标记为DH)、延吉群体9尾(图们江水系,标记为YJ)和法台群体12尾(太子河水系,标记为FT)。样本体长为9~16cm,体重为11~42g。每尾剪取鳍条1~2g,保存于95%酒精内带回实验室。、引物设计、,利用天根生化科技有限公司的基因组提取试剂盒(DP304),按照试剂盒说明书提取总DNA。根据GeneBank中拉氏近缘种Phoxinusujmonensis()、Phoxinusphoxinus()和Rhynchocyprislagowski()提供的mtDNA全序列,通过比对获得目的基因两侧的保守序列,-loop和Cytb序列的2对引物,由生工生物(上海)有限公司合成。D-loop引物为DF(5'-TTAGCGTGAAAGCATCGG-3')和DR(5'-GTGTAAGTTGGGTTAGAGC-3');Cytb引物为CF(5'-TACGA-3')和CR(5'-AGGATTTGCTGAGTGTAG-3')。PCR反应体系为25μL:×PCRbuffer(Mg2+plus,20mM)、2μLdNTPmix()、(5U/μL)、上下游引物各1μL(10μM)、模板1μL,双蒸水补足至25μL。PCR扩增条件为:94℃预变性5min;35个循环,每个循环包括94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min30s;最后73延伸10min。本研究所有的PCR反应均在ABI9700扩增仪上进行,%琼脂糖凝胶电泳检测,获得目的条带的产物于-20℃冰箱内保存备用。PCR产物送至生工生物(上海)有限公司进行纯化,并由ABI3730全自动测序仪双向测序,测序引物为上述PCR扩增引物。(DNAS-tar,Inc)中的SeqMan程序进行拼接。,辅以人工矫正;并运用该软件包计算序列碱基组成、变异位点数和转换与颠换值;利用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)基于Kimura双参数法(Kimura2-parameter,K2p)模型构建系统进化树,采用Bootstrap(1000个循环)检验节点的置信度。利用DnaSP()软件统计单倍型、单倍型多样性(h)、平均核苷酸差异数(K)及核苷酸多样性(Pi)。(AMOVA)方法计算遗传分化指数(Fst),分析遗传变异来源于组成。-°22′″;E128°13′″吉林省延吉市N42°53′″;E129°30′″本溪市本溪县法台村N41°22′″;E124°0′″样品数8912从3个群体29尾个体的D-loop和Cytb序列中,分别获得了长度为783~785bpD-loop和818bpCytb的同源序列(表2)。在线粒体D-loop同源序列中检测出47个变异位点,约占总位点的6%,其中简约信息位点43个,单突变位点4个;发生碱基转换的位点有30个,A/%,远高于T/C转换(%);颠换的位点有17个,A/T颠换比例最大(%),A/C颠换次之(%),G/C颠换最小(%);有2个插入/缺失位点,仅见于敦化群体(DH)。D-loop基因序列的A、T、G、%、%、%%,A+T含量(%)大于G+C含量(%)。在获得的818bpCytb同源序列中,变异位点89个,%,其中简约信息位点87个,单突变位点2个;转换数为80,其中T/%,A/G转换较小(%);颠换数为10,A/T颠换比例最大(%),A/C颠换次之(%),G/C颠换比例最小(%),缺少碱基缺失/插入位点;Cytb基因片段中A、T、G、%、%、%%,A+T含量(56%)大于G+C含量(44%)。D-loop和Cytb碱基组成呈较明显的AT偏好和很强的反G偏歧。-loop序列的单倍型多样性、、;~~;单倍型多样性指数大小顺序为YJ>DH>FT,而核苷酸多样性指数的大小顺序为DH>YJ>FT。3个群体总体的基于Cytb基因片段单倍型多样性、、;~,YJ群体最高,FT群体次之,DH群体最小;~,各群体该指数的大小顺序为DH>YJ>FT(表2)。综合D-loop和Cytb序列的遗传多样性参数可知,3个拉氏群体总体的单倍型多样性指数较高,除DH群体外,其余两个群体的核苷酸多样性指数均处于较低水平。用Kimura双参数法(Kimura2-parameter,K2p)计算3个群体间遗传距离和遗传分化指数(表3)。基于D-loop序列的计算结果表明,~,大小顺序为DH>YJ>FT;~,YJ与FT群体间距离最大,YJ与DH群体间次之,DH与FT群体间最小。基于Cytb序列的分析结果显示:YJ与FT群体的群体内遗传距离相等且较小,,小于DH群体的群体内遗传距离();~,两两群体间遗传距离大小顺序与基于D-loop序列一致。遗传分化分析表明,基于D-~~,,达极显著水平(P<),表明群体间分化显著。表2拉氏3个群体D--loopandCytbgenesinthreepopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky表2拉氏3个群体D--loopandCytbgenesinthreepopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky注:*P<-loopCytb遗传多样性参数个体/个序列长度/bp变异位点/个转换/颠换/个插入/缺失数/个单倍型数/个单倍型多样性指数核苷酸多样性指数平均核苷酸差异数Fu'FsP值DH8783-7853720/17YJ978477/0FT1278555/0DH88187768/9YJ981874/1FT1281855/-*-*.-.,方差剖分显示遗传变异主要源于群体间,基于D-%%。把3个群体归为一个整体时,(D-loop)(Cytb),二者的P=,表明群体间已出现显著分化。表3拉氏3个群体D-loop和Cytb基因群体间/群体内的Kimura2--parameterbyD-loopandCytbgenesamongandwithinpopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky表3拉氏3个群体D-loop和Cytb基因群体间/群体内的Kimura2--parameterbyD-loopandCytbgenesamongandwithinpopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky注:左下角为群体间遗传距离;对角线上为群体内遗传距离;右上角为群体间遗传分化;*P<-******-loop和Cytb测序结果经比对分别定义了15和11个单倍型(表5)。在D-Loop序列的单倍型中,除Hap2为DH和YJ共享外,其余单倍型为各群体特有;各群体中不同单倍型的比例显示,DH、YJ和FT群体的优势单倍型分别为Hap1、Hap2(Hap10)和Hap6。在Cytb的单倍型中,除Hap3为YJ和DH共享外,其余单倍型为各群体特有;DH、YJ和FT群体的优势单倍型分别为Hap1、Hap9和Hap7。基于K2p算法,D-~,;~,。用邻接法构建的进化树的聚类结果显示,基于D-loop和Cytb的单倍型,进化树分为2个分支:1个分支以延吉群体为主,另1个以法台群体为主,而敦化群体的单倍型在两个分支上均有分布(图1和图2)。表4拉氏3个群体D--loopandCytbgenesinthreepopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky表4拉氏3个群体D--loopandCytbgenesinthreepopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky变异来源群体间群体内总体固定指数自由度22628D-/%(P=)(P=)方差比例/%、类型、,type,frequencyanddistributioninthreepopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowsky表5拉氏3个群体单倍型数目、类型、,type,frequencyanddistributioninthreepopulationsoffatminnowPhoxinuslagowskiiDybowskyD-loopCytb单倍型FT(12)YJ(9)FT(12)Hap1Hap2Hap3Hap4Hap5Hap6Hap7Hap8Hap9Hap10Hap11Hap12Hap13Hap14Hap15DH(8)5(%)1(%)1(%)1(%)YJ(9)02(%)0000DH(8)6(75%)1(%)1(%)002(%)0000000000000000000001(%)8(%)1(%)1(%)1(%)00002(%)1(%)3(25%)6(50%)2(%)1(%)1(%)1(%)1(%)1(%)000000单倍型总数5(%)3(%)1(%)1(%)1(%)8(%)1(%)1(%)1(%)2(%)1(%)1(%)1(%)1(%)1(%)00000000----1(%)3(%)1(%)2(%)单倍型总数6(%)1(%)3(%)2(%)1(%)3(%)6(%)1(%)3(%)1(%)2(%)----0000---------loop和Cytb序列碱基组成本研究获得的D-loop和Cytb基因同源片段序列中,碱基组成的分布较为一致:T含量最高,G含量最低;A+T含量高于G+C含量。这与其他鱼类线粒体DNA碱基组成相同[15-18],符合动物线粒体基因组中4种核苷酸不均一分布这

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