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浓缩鱼油对前列腺细胞生长的影响.docx


文档分类:文学/艺术/军事/历史 | 页数:约18页 举报非法文档有奖
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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。浓缩鱼油对前列腺细胞生长的影响??沈钰珍,于海宁,张程程,曾思敏,沈生荣,*(.浙江大学,生物系统工程与食品科学学院食品生物科学技术研究所,浙江杭州30058;.浙江工业大学药学院,浙江杭州3004)浓缩鱼油对前列腺细胞生长的影响沈钰珍1,于海宁2,张程程1,曾思敏1,沈生荣1,*(,生物系统工程与食品科学学院食品生物科学技术研究所,浙江杭州310058;,浙江杭州310014)探讨了鱼油对前列腺正常细胞(RWPE-1)和前列腺癌细胞(PC-3)生长和代谢的影响。经鱼油处理,MTT法及流式细胞术考察鱼油对以上两细胞生长的影响,气相色谱法分析处理前后脂肪酸组成,酶联免疫法检测细胞炎性因子(TNF-α,IL-6,LXA4)的表达。结果显示,本实验所用浓缩鱼油基本不影响前列腺正常细胞RWPE-1的生长,而50倍稀释鱼油作用48h可使PC-%,%±%;鱼油作用后PC-3细胞内γ-亚麻酸、花生四烯酸、EPA和DHA比例明显增加,而在RWPE-1细胞内并无明显增加;RWPE-1细胞的LXA4表达量基本不变,IL-6和TNF-α表达量逐渐上升,而PC-3细胞的LXA4表达量呈明显上升趋势,IL-6、TNF-α的表达量却显著下降。本实验所用浓缩鱼油对RWPE-1和PC-3细胞的生长、代谢具有不同的影响。鱼油,前列腺癌,细胞凋亡,脂肪酸组成,炎性因子流行病学调查发现,摄入一定量的鱼油可以降低前列腺癌症的发病率[1]。鱼油中含大量的多不饱和脂肪酸,其中EPA和DHA是深海鱼油的特征脂肪酸。n-3多不饱和脂肪酸在多种疾病的预防及治疗方面得到了广泛的应用[2-3]。研究发现,n-3多不饱和脂肪酸对机体下调炎症细胞因子表达,如IL-l、IL-6、TNF-α,起到免疫调节的作用[4],而且对很多癌症具有预防、治疗作用。近来,越来越多的研究表明n-3多不饱和脂肪酸(DHA、EPA)在肿瘤治疗方面有着重要的作用[5],其中有研究证明n-3和n-6多不饱和脂肪酸有降低前列腺癌风险的作用[6-7]。同时,有关实验证实,n-3多不饱和脂肪酸(如DHA、EPA)可以抑制前列腺癌细胞增殖并联合化疗药物达到化疗增敏的作用[8]。细胞内脂肪酸比例变化会影响细胞的生存状态,膳食或细胞中n-6/n-3的比值发生变化将会影响细胞生存,并引起很多细胞功能发生变化[9]。鱼油中存在天然配比的n-3,n-6多不饱和脂肪酸,在降低癌症及心血管疾病方面有着独特的优势。Saw等研究证明鱼油对高脂饮食下的前列腺癌小鼠有一定的保护作用[10]。研究表明,n-3和n-6多不饱和脂肪酸对前列腺癌症有预防、治疗作用[11-12],但其在正常细胞和癌细胞中的代谢差异研究并不多。本文选取市售浓缩鱼油研究其对前列腺正常细胞(RWPE-1)和前列腺癌细胞(PC-3)的生长、代谢的影响,希望通过本研究能更好地阐释鱼油在防治前列腺癌症方面的作用。-3、前列腺上皮正常细胞RWPE-1中科院细胞生物所;MTTSigma公司;RPMI1640培养基、胎牛血清、双抗Gibco公司;SOD、CAT、GSH-Px、MDA试剂盒和蛋白测定试剂盒南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-6酶联免疫试剂盒武汉博士德生物工程有限公司;LXA4酶联免疫试剂盒上海源叶生物科技有限公司;正己烷国产色谱纯;浓缩鱼油软胶囊。W201型恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司;LDIX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;L500型低速离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;二氧化碳培养箱SheLLbaMSA公司;MD29SpectraMax190型酶标仪芬兰;7890-A型安捷伦气相色谱安捷伦公司;FC500MCL型流式细胞仪美国BeckmanCoulter。[13]取1mL鱼油置于具塞玻璃试管内,快速加入5%盐酸甲醇(w/v)3mL,密封后立即放入100℃恒温箱甲酯化3h,取出冷却至室温,加入等体积高纯水,用3mL正己烷分3次萃取,将正己烷相合并后加入等体积高纯水洗涤,回收正己烷相,过滤后用氮气吹干,用正己烷定容至1mL,取1μL进样,分流比为1∶10。气相色谱条件:进样口温度250℃,检测器温度260℃,色谱柱为DB-23(,60m,安捷伦,美国),程序升温条件:130℃保留1min,℃/min升至170℃,℃/min升至225℃并保留10min。用动物源脂肪酸甲酯混标(FAMEMix,Supelco)进行脂肪酸外标法定量。-1和PC-3细胞存活率的影响用无水乙醇溶解鱼油形成10倍稀释液,实验前用细胞培养液稀释鱼油成200、150、100、50倍的鱼油稀释液。RWPE-1和PC-3培养条件:RPMI1640培养液中加10%胎牛血清和双抗(青霉素和链霉素各100U/mL),37℃,5%CO2。将对数生长期的RWPE-1和PC-3细胞分别以5×104个/mL和1×105个/mL密度接种于96孔板,每组设6个平行,每孔设培养液对照。24h后加入不同稀释倍数的鱼油,无水乙醇为溶剂对照,继续培养。分别于24、48、72h后取出,甩掉孔内培养液,每孔加入20μLMTT(5mg/mL),CO2培养箱内放置4h后,每孔加入150μLDMSO,水平振荡器摇匀直至蓝紫色结晶溶解完全,用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值。鱼油对照孔与溶剂对照孔的吸光度百分比为细胞存活率,存活率计算公式如下:-1和PC-3细胞凋亡变化取对数生长期细胞(RWPE-1:5×104个/mL,PC-3:1×105个/mL)接种于6孔板,24h后加入稀释鱼油处理48h。处理完成后,收集细胞并用预冷PBS洗涤细胞两次,AnnexinV结合液悬浮细胞,细胞密度约为10个/mL,按1∶80加入AnnexinV-FITC染色液,轻轻混匀后于4℃避光染色15min,按1∶40加入PI染色液(50μg/mL),轻轻混匀后于4℃避光染色5min,1h内用流式细胞仪检测。-1和PC-3细胞SOD、CAT及GSH-Px活力和MDA含量取对数生长期细胞(RWPE-1:5×104个/mL,PC-3:1×105个/mL)接种于6孔板,24h后用稀释鱼油处理48h。收集细胞,PBS洗涤细胞两次,重悬于200μLPBS中,于冰浴中超声破碎细胞,细胞破碎液用于SOD、MDA、CAT及GSH-Px含量测定,测定方法参照试剂盒说明书。蛋白测定参照蛋白测定试剂盒说明书进行。SOD、CAT及GSH-Px活性表示为U/mgprotein,MDA含量表示为nmol/mgprotein。-1和PC-3细胞内脂肪酸组成[14]RWPE-1和PC-3细胞分别以5×104个/mL和1×105个/mL密度接种于细胞培养瓶内,24h后用稀释鱼油处理48h,同时做空白对照。鱼油处理后,胰酶消化细胞并离心收集细胞,PBS洗涤细胞两次,将细胞转移到具塞玻璃试管内,,最后用正己烷定容至100μL,取1μL进样,不分流。。-1和PC-3细胞内炎性因子(TNF-α,IL-6,LXA4)的表达[15]取对数生长期细胞RWPE-1和PC-3接种于6孔板中,密度分别为5×104个/mL和1×105个/mL,24h后加入稀释鱼油处理48h,收集细胞培养液用于细胞内炎性因子(TNF-α,IL-6,LXA4)的测定,检测前将细胞培养液离心去除死细胞,测定方法参照试剂盒说明书。细胞悬浮液用于蛋白测定,参照试剂盒说明书进行。炎性因子表达量表示为ng/mgprotein。本文最终以各处理下炎性因子表达量相对于空白对照组的百分含量表示鱼油处理后炎性因子表达的变化。,绘图采用Excel2003,数据表示为平均值±SD。,本文所用鱼油为浓缩鱼油,产品标签上显示每粒重量为1g,其中含EPA300mg,DHA200mg。图2为鱼油的气相色谱图,根据气相分析结果发现该鱼油中含有多种脂肪酸,%,%(如表1所示),与鱼油标签上所示基本一致。从表1可以看出鱼油中含有多种脂肪酸,%%,γ-亚麻酸、%、%。-1和PC-3细胞存活率的影响如图3所示,随着鱼油浓度(200、150、100、50倍稀释)增加,RWPE-1细胞存活率呈上升趋势,并随培养时间的延长而逐渐升高。而PC-3细胞的存活率随鱼油浓度上升呈下降趋势(图4),且在50倍稀释浓度下存活率有较大幅度的下降,%,%。由此可以看出,鱼油对RWPE-1细胞基本没有杀伤力,对PC-3细胞有一定的杀伤作用。图3鱼油对RWPE--1cells图4鱼油对PC---1和PC-3细胞凋亡的影响通过流式细胞仪可将正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和死细胞区分开来。从表2中可以看到,RWPE-1和PC-3在未经鱼油处理时(CK组)表现出良好的生长状态,死细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞的比例几乎为零。鱼油作用下,RWPE-1和PC-3都发生了一定程度的凋亡,且PC-3的凋亡、死亡情况较RWPE-1严重。100倍稀释鱼油作用下,RWPE-%±%、%±%,而PC-%±%%±%;50倍稀释鱼油作用下,%±%%±%的RWPE-1分别发生了早凋、晚凋现象,而在PC-%±%%±%。与RWPE-1相比,鱼油对PC-3的凋亡影响更大。-1和PC-3细胞SOD、CAT及GSH-Px活力和MDA含量的影响从图5~图8可以看出,经100、50倍稀释鱼油作用48h后,RWPE-1内SOD和GSH-Px的活力基本维持在一个水平;而PC-3内SOD活力明显下降,GSH-Px活力却有较大幅度的上升,特别是在50倍稀释鱼油作用下(图5和图8)。与此同时,经鱼油处理后,RWPE-1内的MDA含量有所上升,但相对PC-3还是处于一个较低的水平(图6);图7显示鱼油作用下RWPE-1和PC-3的CAT活力有很大幅度的下降。表明鱼油对RWPE-1和PC-3的抗氧化系统均有一定程度的损伤。表2鱼油处理后RWPE-1和PC-3细胞凋亡中B1、B2、B3、B4区所占比例变化Table2PercentagechangesofB1,B2,B3,B4areainapoptosisofRWPE-1andPC-3cellstreatedwithfishoil图5鱼油对RWPE-1和PC--1andPC-3cells图6鱼油对RWPE-1和PC--1andPC-3cells图7鱼油对RWPE-1和PC--1andPC-3cells图8鱼油对RWPE-1和PC-3细胞GSH--PxactivityofRWPE-1andPC-3cells图9鱼油对PC-3细胞内饱和脂肪酸、n-9、n-6、n-,n-9,n-6,n-3PUFAsinPC--1和PC-3细胞内脂肪酸组成变化从图9、图10和表3、表4可以看出,RWPE-1和PC-3细胞内的脂肪酸组成存在显著差异。与PC-3相比,RWPE-1内棕榈烯酸(%±%)、γ-亚麻酸(%±%)、花生四烯酸(%±%)含量明显较高。鱼油作用后,RWPE-1和PC-3内饱和脂肪酸的比例均呈上升趋势,50倍稀释鱼油处理下其比例均接近50%。从图9可以看出,随着鱼油浓度的上升,PC-3内n-9PUFAs的比例逐渐下降,对照组、100倍鱼油处理组、%±%、%±%、%±%,n-%±%%±%。而RWPE-1内n-9和n-3PUFAs的比例没有发生显著变化,但n-%±%%±%%±%。图10鱼油对RWPE-1细胞内饱和脂肪酸、n-9、n-6、n-,n-9,n-6,n-3PUFAsinRWPE-1cells表3PC-3细胞内主要脂肪酸比例变化Table3ProportionchangesofmajorfattyacidsinPC-3cells鱼油作用后,PC-3内γ-亚麻酸(%±%%±%、%±%)、花生四烯酸(%±%%±%、%±%)、EPA(%±%%±%、%±%)、DHA(%±%、%±%)比例均明显增加(表3),说明鱼油进入PC-3细胞后可代谢成不同种类的脂肪酸。相同浓度的鱼油作用下,RWPE-1内γ-亚麻酸、花生四烯酸、EPA和DHA比例的增加并不明显(表4),而这四种脂肪酸的比例在PC-3内却将显著升高。表4RWPE-1细胞内主要脂肪酸比例变化Table4ProportionchangesofmajorfattyacidsinRWPE-1cells

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