昆虫的水平基因转移研究.docx

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.,2015;Arakawa,2016;Bemmetal.,2016;DelmontandEren,2016;Koutsovoulosetal.,2016;Yoshidaetal.,2017)。KuandMartin(2016)认为,真核蛋白与原核蛋白的一致度在70%以上时很可能是测序污染、组装或者注释等技术的问题,并提出了70%原则防止HGT的误判。因此,搜索出来的候选HGT还需要进行进一步的验证,防止污染序列的影响。此外,HGT搜索前的基因组组装、预测和注释阶段同样可能给HGT的检测带来影响,例如寄生蜂Leptopilinaheterotoma的Lar基因为处于另一基因RRP8的长内含子内的嵌套基因(nestedgene),昆虫基因组中也含有较多嵌套基因,然而,基因预测中常用的EVidenceModeler等软件默认情况下并不进行嵌套基因的预测(Haasetal.,2008;Huangetal.,2021),有可能造成HGT挖掘的不全面。对于现阶段的昆虫及其它后生动物研究,HGT的搜索还无法做到准确的认定HGT事件及排除污染,只能以灵敏度为主,确定候选HGT的范围,并交由系统发育分析进行进一步的验证与认定,以及使用多种手段排除污染的可能。:系统发育分析与排除污染为了验证HGT候选基因的进化历程和供体来源,进一步确认HGT事件,需要对候选基因及搜索到的同源基因进行系统发育构建,这在HGT研究中是定性的必要环节,但由于同源基因等序列资源配置较为繁琐,通常在流程化的同源性搜索确定候选范围后再进行。系统发育关系可以使用RAxML(Stamatakis,2014)或IQ-TREE(Minhetal.,2020)等软件构建得到。随后在构建出的进化树中观察基因的进化历程,若候选基因或候选基因集在进化树上被非近源物种的基因包围,则这些基因可能是HGT基因,那些相邻支系的物种可能是HGT的供体。除此之外,昆虫及其他后生动物的候选HGT还应排除可能为污染的情况。首先,需要验证候选基因周围的侧翼基因或片段序列属于真核生物,如利用基因组的注释信息BLAST搜索周围序列,还可以进一步采用PCR方法或者高通量数据中对应的原始序列验证基因的连接处。另外,不同个体、种群与物种的数据可以使用BLAST相互印证,排除某个数据的污染,也可以用PCR直接验证准备好的生物样品,这一过程可以说明该基因在该物种或该类群的共同祖先出现前就已经发生了HGT事件。真核基因的特征也可以用来辅助验证,比较常用的特征包括内含子、信号肽、polyA位点和GC含量等。部分真核基因中含有内含子,研究表明内含子能够增加基因的表达(LeHiretal.,2003),因此可以证明含有内含子的基因来自真核生物,检测HGT候选基因中是否存在内含子,也是对基因结构的描述,这一步可以通过基因组的注释信息或PCR进行验证。真核生物分泌系统的信号肽与原核生物不同,用SignalP(Armenterosetal.,2019)等软件进行真核信号肽的预测,若HGT候选基因含有信号肽,则可以证明该基因为真核基因,并且为分泌蛋白。可以使用转录组或qRT-PCR等方法验证该基因是否表达,同时得到该基因的表达谱。如果表达,不但能较大程度排除污染的可能性,还可以说明该基因在生物体中发挥了作用,通过表达谱也能推测该基因的作用。此外,转录本中的polyA位点也可以进一步说明该基因为真核基因。:生物信息学与实验HGT的功能探究通常可以分为生物信息学和实验两方面的探究。生物信息学分析包括了信号肽、结构域、同源性注释、催化位点及蛋白结构等序列信息的分析,除此之外,选择压力分析也是常见的分析之一。基因在进化过程中经历正选择或负选择说明该基因在进化过程中发挥了重要的作用,选择压力可以使用HyPhy(Pondetal.,2020)或PAML程序包的CODEML程序(Yang,2007)进行检测。实验方面,主要包括表达谱和功能验证实验。通过转录组或qRT-PCR等手段获取基因在各部位或各发育阶段的时空表达谱以及不同实验处理的表达谱,不同情况下某一基因的表达上下调情况有利于间接推测该基因的作用。在表达谱和序列信息分析的基础上,可以提出对基因功能的合理假设,设计实验验证基因的功能,常用的实验手段包括RNA干扰、体外表达与底物实验等。2昆虫水平基因转移的供体HGT的供体是指提供基因的物种,即HGT基因的来源。HGT的供体通常是通过构建基因的进化树推断的,但由于数据库的物种缺失、系统发育推断的不确定性以及古老物种和现存物种的差异等,推测得出的HGT供体很可能并不是客观的供体。Crispetal.(2015)通过HGT指数h的方法搜索了果蝇属Drosophila的基因组,结果表明HGT主要来自细菌(%)和原生动物(%),也有来自植物(%)、真菌(%)和古菌(%)的HGT。然而,从现有研究来看,昆虫HGT