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高产dl-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。高产dl-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法专利名称:高产dl-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法技术领域:本发明属分析化学及应用微生物学领域,具体涉及通过应用HPLC测定MRS发酵上清中苯乳酸含量(phenyllacticacid,PLA),从而筛选高产苯乳酸乳酸菌菌株的方法。背景技术:近年来,化学防腐剂和兽药残留已日益危害人类及动物的健康,广谱、高效、稳定、安全的新型抗菌物质的开发与研究已成为当务之急。乳酸菌是人体及动物肠道内的正常菌群,亦是公认安全(GRAS,GenerallyRecognizedAsSafe)的食品级微生物(Food-anisms)0乳酸菌在食品发酵过程中不仅赋予发酵食品特有的风味、质地和结构,而且还能产生多种可以有效抑制食源性致病微生物的生长与繁殖的细菌素(bacteriocin)、环二肽(cyclicdipeptides)、anicacid)、过氧化氢(hydrogenperoxid)、双乙酞(diacetyl)等抑菌因子,基于乳酸菌的安全性和在食品工业中的重要地位,以乳酸菌及其代谢产物开发新型生物防腐剂已成为生物保藏(biopreservation)领域的研究重点和热点。DL-3苯乳酸(DL-3-phenyllacticacid,PLA),即2-羟基-3-苯基丙酸是近年来发现的可以由部分乳酸菌分泌产生的一种新型生物防腐剂,有D-苯乳酸和L-苯乳酸两种对应异构体。它能够较好地抑制多种引起食物***的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和产生霉菌***的真菌。苯乳酸具有安全、无毒,在低浓度下不影响食品的风味与口感、作为新型饲料添加剂具有提高禽畜免疫力和肉质等优点。此外,DL-3苯乳酸还是丹参素(β-3,4-二羟基苯基乳酸钠)的衍生物之一,具有与丹参素类似的药理作用,能够抑制血小板聚集、抑制血栓形成及改善微循环,对缺血性心脏病具有一定的药用价值。随着我国对食品安全的日益重视,DL-3苯乳酸的开发和利用具有广泛的应用前景。目前已知的能够分泌产生苯乳酸的乳酸菌菌株产量较低,以MRS(DeMan-Rogosa-Sharpebroth)为培养基,在没有经过任何条件优化的情况下最高产量为99mg/L,严重限制了DL-3苯乳酸的生物合成和应用,因此高产该有机酸菌株的筛选势在必行。然而筛选方法必需建立在一种简便、快速且同时能定性及定量的检测方法基础上。目前苯乳酸的检测方法主要有薄层层析、高分辨气质联用、液质联用和高效液相色谱法。薄层层析只能定性和半定量检测苯乳酸,高分辨气质联用和液质联用具有高通量、自动化程度和分辨率高等优点,但价格高昂,不适合常规实验室进行普筛;而已知的苯乳酸的HPLC检测方法需要诸如液液萃取、固液萃取和PH调节等复杂的样品前处理,完成一个样品检测至少需要2-3小时,不能适应快速分析检测的需要。MRS培养基(DeMan-Rogosa-Sharpebroth)是乳酸菌的选择性培养基,也是乳酸菌开展相关科学研究的首选培养基。因此,建立从MRS发酵液中检测苯DL-3苯乳酸的快速简便方法,对于高产DL-3苯乳酸乳酸菌菌株的快速筛选及定性与定量检测具有重要意义。发明内容本发明的目的是应用HPLC对乳酸菌MRS发酵上清中DL_3_苯乳酸进行定性与定量测定后,建立一种快速而简便的高产苯乳酸乳酸菌菌株的筛选体系。本发明的上述目的,是通过下面的技术方案得以实现的DL-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法,包括培养基的配置与样品前处理、HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量进行定性、定量检测。所说培养上清的配制采用乳酸菌MRS发酵液4°C,6000rpm离心lOmin,。所说样品前处理为配置DL-3-苯乳酸标准贮备液和工作液准确称取()mgDL-3"苯乳酸标准品,用甲醇溶解定容至IOOmL,即为lg/LDL_3_苯乳酸标准贮备液,于_4°C保存;吸取DL-3-苯乳酸标准贮备液,以甲醇为溶剂定容,配制浓度为O、60、100、200、400、600、800mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液。所说用PLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定性检测是采用反相离子抑制技术,%磷酸V/V,抑制DL-3-苯乳酸解离,利用AgilentZorbaxSB-C186mmX150mm,5μm)色谱柱,使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离,通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测。所说HPLC对MRS发酵上清中DL_3_苯乳酸含量定量检测是将一系列已知浓度的DL-3-苯乳酸标准工作液进样分析,以DL-3-苯乳酸样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标建立标准曲线,并计算回归方程。所说培养基的配置采用乳酸菌MRS发酵液4°C,6000rpm离心lOmin,;所说样品前处理为配置DL-3-苯乳酸标准贮备液和工作液准确称取()mgDL-3-苯乳酸标准品,用甲醇溶解定容至IOOmL,即为lg/LDL-3-苯乳酸标准贮备液,于_4°C保存;吸取DL-3-苯乳酸标准贮备液,以甲醇为溶剂定容,配制浓度为0、60、100、200、400、600、800mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液;所说HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定性检测是采用反相离子抑制技术,%磷酸V/V,抑制DL-3-苯乳酸解离,利用AgilenUorbaxSB-C18(,5μm)色谱柱,使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离,通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测;所说HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定量检测是将一系列已知浓度的DL-3-苯乳酸标准工作液进样分析,以DL-3-苯乳酸样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标建立标准曲线,并计算回归方程。进一步对该筛选方法进行精密度、重复性、稳定性与加标回收率检测,所说精密度检测是取浓度分别为100、200、400mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液分别重复进样5次进行分析,并计算3个浓度对应的峰面积相对标准偏差;所说重复性和稳定性检测是在一个工作日内重复检测浓度分别为100、200、400mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液5次(日内精密度),并每隔24h对样品溶液进行检测,重复操作5次(日间精密度),并计算的峰面积相对标准偏差;加标回收率检测是将3个浓度梯度的DL-3-苯乳酸标准品加入浓度已知的乳酸菌MRS发酵上清培养上清液中,对其进行5次重复测定,并计算的峰面积相对标准偏差。本发明的技术方案可概括为高产DL-3-苯乳酸的乳酸菌菌株的快速筛选体系。DL-3-苯乳酸为弱酸性物质(pKa=),中性流动相中易发生离解,采用反相离子抑制技术,%磷酸(V/V),抑制DL-3-苯乳酸解离,利用AgilentZorbaxSB-C18(,5μm)色谱柱,使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离,通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中苯乳酸样品的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测,外标法进行定量检测。HPLC色谱条件高效液相色谱仪型号为安捷伦1200色谱柱=AgilentZorbaxSB-C18(,5ym)色谱柱;流动相:A:%磷酸(V/V),B:%磷酸乙***溶液(V/V);流速lmL/min;柱温:30°C;进样量:5μL;检测波长210nm。图1为D-苯乳酸和L-苯乳酸两种对应异构体;图2为DL-3-苯乳酸标准品紫外光谱图;图3为乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸紫外光谱图;图4为DL-3-苯乳酸标准品色谱图;图5为乳酸菌MRS发酵上清色谱图;图6为DL-3-苯乳酸标准曲线;图7为产DL-3苯乳酸乳酸菌菌株的快速筛选结果。具体实施方案实施例1:(DeMan-Rogosa-Sharpebroth)培养基购于英国Oxoid公司,,Lab-,,,Tween-,,,,,。称取MRS粉末52g,充分溶解后用ddH20定容至1L,试管分装,每支5mL,加塞包扎,标记,121°C高压灭菌15min,冷却后4°C保存。-80°C冰箱中冷冻保藏的乳酸菌纯菌种取出,置于生物安全柜内,待其融解液化后,混勻,用微量移液器取IOyL接种于5mL灭菌MRS肉汤培养基中,置于(36士1)°C摇床培#°C,6000rpm离心IOmin,。-3--3-苯乳酸标准贮备液制备准确称取()mgDL_3_苯乳酸标准品,用甲醇(色谱纯)溶解定容至IOOmL,即为lg/LDL-3-苯乳酸标准贮备液,_4°C保存。-3-苯乳酸标准工作液的配置吸取DL-3-苯乳酸标准贮备液,以甲醇为溶剂定容,配制浓度为0、60、100、200、400、600、800mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液。:AgilentZorbaxSB-C18(,5μm)色谱柱;流动相=A:%磷酸(V/V),B:%磷酸乙***溶液(V/V);流速lmL/min;柱温30°C;进样量5μL;检测波长210nm;洗脱程序见表1。采用标样与乳酸菌MRS发酵上清中苯乳酸样品的保留时间及光谱图对照的方法进行苯乳酸定性分析。-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法,包括培养基的配置与样品前处理、HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量进行定性、定量检测。,其特征在于所说MRS发酵上清是用乳酸菌MRS发酵液4°C,6000rpm离心lOmin,。,其特征在于所述样品前处理为配制DL-3--3-苯乳酸标准品,用甲醇溶解定容至IOOmL,即为lg/LDL-3-苯乳酸标准贮备液,于_4°C保存;吸取DL-3-苯乳酸标准贮备液,以甲醇为溶剂定容,配制浓度为0、60、100、200、400、600、800mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液。,其特征在于所述HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定性检测是采用反相离子抑制技术,%磷酸V/V,抑制DL-3-苯乳酸解离,利用AgilentZorbaxSB-C18色谱柱,使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离,通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测。,其特征在于所述HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定量检测是将一系列已知浓度的DL-3-苯乳酸标准工作液进样分析,以DL-3-苯乳酸样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标建立标准曲线,并计算回归方程。,其特征在于所说培养上清的配制采用乳酸菌MRS发酵液4°C,6000rpm离心lOmin,;所说样品前处理为配制DL-3--3-苯乳酸标准品,用甲醇溶解定容至IOOmL,即为lg/LDL-3-苯乳酸标准贮备液,于-4°C保存;吸取DL-3-苯乳酸标准贮备液,以甲醇为溶剂定容,配制浓度为0、60、100、200、400、600、800mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液;所说HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定性检测是采用反相离子抑制技术,%磷酸V/V,抑制DL-3-苯乳酸解离,利用AgilentZorbaxSB-C18色谱柱,使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离,通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测;所说HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量定量检测是将一系列已知浓度的DL-3-苯乳酸标准工作液进样分析,以DL-3-苯乳酸样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标建立标准曲线,并计算回归方程。,其特征在于进一步对该筛选方法进行精密度、重复性、稳定性与加标回收率检测,所说精密度检测是取浓度分别为100、200、400mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液分别重复进样5次进行分析,并计算3个浓度对应的峰面积相对标准偏差;所说重复性和稳定性检测是在一个工作日内重复检测浓度分别为100、200、400mg/L的DL-3-苯乳酸标准工作液5次,并每隔24h对样品溶液进行检测,重复操作5次,并计算的峰面积相对标准偏差;加标回收率检测是将3个浓度梯度的DL-3-苯乳酸标准品加入浓度已知的乳酸菌MRS发酵上清培养上清液中,对其进行5次重复测定,并计算的峰面积相对标准偏差。全文摘要本发明涉及一种高产DL-3-苯乳酸乳酸菌菌株的筛选方法,应用HPLC对MRS发酵上清中DL-3-苯乳酸含量进行定性与定量分析,从而对高产苯乳酸乳酸菌菌株进行快速筛选,属分析化学与应用微生物领域。采用反相离子抑制技术,%磷酸(V/V),抑制DL-3-苯乳酸解离,利用AgilentZorbaxSB-C18(×150mm,5μm)色谱柱,使DL-3-苯乳酸与乳酸菌MRS发酵上清液中杂质分离,通过对比标样与乳酸菌MRS发酵上清中苯乳酸样品的保留时间及光谱图进行DL-3-苯乳酸定性检测,外标法进行定量检测。本发明具有快速、准确和样品前处理简单等优点,为高产苯乳酸乳酸菌菌株的快速筛选、定性和定量检测提供技术手段。

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