一种mhc限制性杀伤t细胞的体外诱导培养方法.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种mhc限制性杀伤t细胞的体外诱导培养方法一种mhc限制性杀伤t细胞的体外诱导培养方法本发明涉及细胞体外诱导培养及扩增【技术领域】,特别涉及一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法:分离脐带血单个核细胞;脐带血单个核细胞放入培养基中培养,采用含10%FBS的RPMI-1640为基础培养基,添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用。使用脐血中提取的MNC细胞作为原料,通过添加细胞因子,经过15天的扩增培养获得扩增10-15倍的CTL,并且具有旺盛的杀瘤活性,使脐血可以作为肿瘤过继免疫治疗所需T淋巴细胞的来源;该方法能够获得较其他方法数量更多的CTL,并且体外细胞毒性试验与荧光定量PCR实验检测细胞毒性增强。【专利说明】一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法[0001]【技术领域】本发明涉及细胞体外诱导培养及扩增【技术领域】,特别涉及一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法。[0002]【背景技术】肿瘤过继免疫治疗是指通过向肿瘤患者输注抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤或激发机体免疫反应以达到杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤的目的,过继免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要组成部分,在肿瘤的治疗中起着积极的作用,其中常见的细胞种类包括细胞因子诱导的T细胞(cytokineinducedkillor,CIK细胞)、自然杀伤细胞(Naturekillor,NK细胞)和杀伤性T细胞(cytotoxicTcell,CTL)。其中CTL是机体特异性抗肿瘤免疫的主要效应细胞,是肿瘤免疫治疗中较为理想的效应细胞种类。CTL是一类具有CD3+CD8+表面标志、具有MHCI限制性的T细胞,可以特异性地快速性杀伤靶细胞。虽然CTL受MHCI类分子限制性,T细胞过继免疫疗法须使用患者自身的血液进行,但HLA与患者相同或部分相同的健康个体也可获得特异性的CTL。近年来的研究成果肯定了来自患者体内或经体外肿瘤抗原刺激的肿瘤抗原特异性T细胞过继免疫疗法,但该方法仍有不足之处:患者在疾病状态下免疫细胞功能低下,而且经连续放化疗之后,使体外扩增难度进一步增加。因此寻找功能健全的免疫细胞来源非常必要。[0003]脐带血干细胞是目前的研究热点,其来源丰富,获取方便,含有丰富的造血干细胞和免疫细胞;同时脐血造血干细胞具有多向分化潜能,在造血因子的作用下可以分化扩增。目前技术已能长时间储存脐血,经深低温长期储存的脐血经过多种细胞因子组合诱导分化,可产生大量免疫细胞如CIK细胞和NK细胞,用于肿瘤过继免疫治疗,但有关扩展脐血CTL的报道尚不多见。[0004]虽然很多研究结果显示脐血特异性的CTL的杀伤活性较***外周血CTL低,但脐血T细胞前体和辅助T细胞前体的含量与***外周血相当,受异种抗原刺激的增殖反应强,仍然可作为过继免疫治疗的来源。如脐血T淋巴细胞分泌IFN-Y低于***,但在IL-2刺激后,两者无明显差异。经PHA-P刺激后能够使脐血T淋巴细胞活化,有文献报道,脐血淋巴细胞对不同浓度的植物血凝集素(PHA)和刀豆蛋白A的增殖反应与***相同或高于***,所以脐血T淋巴细胞可望成为肿瘤过继免疫治疗的主要替代细胞来源。[0005]【发明内容】为了解决以上现有技术中本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种MHC限制性杀伤τ细胞(ctl,表型为ra3+ra8+)的体外诱导培养方法。[0006]本发明是通过以下步骤得到的:一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法,包括以下步骤:(1)分离脐带血单个核细胞;(2)脐带血单个核细胞放入培养基中培养,采用含10%FBS的RPM1-1640为基础培养基,添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用,第一阶段为第I天,在基础培养基中加入10-100ng/mL的GM-CSF,lO-lOOng/mL的Y-1FN,10-100ng/mL的IL-15,l_5ug/mL的PHA-P和10-1000IU/mL的IL-4进行培养;第二阶段为第2天,在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF,lO-lOOng/mL的FLT-3L,lO-lOOng/mL的anti_CD3,lO-lOOng/mL的anti_CD28和100-1000IU/mL的IL-2进行培养;第三阶段为第5-8天,在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF,lO-lOOng/mL的FLT-3L,lO-lOOng/mL的IL-15和100-1000IU/mL的IL-2进行培养;第四阶段为第9-15天,在基础培养基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2进行培养。[0007]一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法,包括以下步骤:(1)分离脐带血单个核细胞;(2)脐带血单个核细胞放入培养基中培养,采用含10%FBS的RPM1-1640为基础培养基,添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用,第一阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的GM-CSF,lO-lOOng/mL的Y-1FN,5-50ng/mL的IL-15,l_5ug/mL的PHA-P和10_500IU/mL的IL-4进行培养;第二阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的SCF,10_50ng/mL的FLT-3L,lO-lOOng/mL的ant1-CD3,lO-lOOng/mL的anti_CD28和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养;第三阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的SCF,10-50ng/mL的FLT-3L,5_50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养;第四阶段在基础培养基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养。[0008]所述的体外诱导培养方法,优选第一阶段在基础培养基中加入20ng/mL的GM-CSF,50ng/mL的\-1FN,10ng/mL的IL-15,2ug/mL的PHA-P和100IU/mL的IL-4进行培养;第二阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF,20ng/mL的FLT-3L,50ng/mL的ant1-CD3,50ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2进行培养;第三阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF,20ng/mL的FLT-3L,10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养;第四阶段在基础培养基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养。[0009]所述的体外诱导培养方法,优选在每个阶段中保持细胞密度为5XIO6个/mL。[0010]所述的体外诱导培养方法,优选培养发生在37°C、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内。[0011]所述的体外诱导培养方法,优选分离脐带血单个核细胞的步骤包括:脐带血用淋巴细胞分离液分离,用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。[0012]本发明的有益效果:1)使用脐血中提取的MNC细胞作为原料,通过添加细胞因子,经过15天的扩增培养获得扩增10-15倍的CTL,并且具有旺盛的杀瘤活性,使脐血可以作为肿瘤过继免疫治疗所需T淋巴细胞的来源;2)该方法能够获得较其他方法数量更多的CTL,并且体外细胞毒性试验与荧光定量PCR实验检测细胞毒性增强。[0013]【专利附图】【附图说明】图1是CTL细胞形态学观察和增殖直方图,A为培养前CTL细胞形态学观察(X200);B为培养后CTL细胞形态学观察;图2是流式细胞术检测实施例1细胞表型在培养前后的变化,其中A、D、G为CTL细胞培养前后CD3CD8表型变化图;B、E、H为CTL细胞培养前后CD4CD25表型变化图;C、F、I为CTL细胞培养前后⑶3⑶56表型变化图;图3是流式细胞术检测实施例2细胞表型在培养前后的变化,其中A、D、G为CTL细胞培养前后CD3CD8表型变化图;B、E、H为CTL细胞培养前后CD4CD25表型变化图;C、F、I为CTL细胞培养前后⑶3⑶56表型变化图;图4是流式细胞术检测实施例3细胞表型在培养前后的变化,其中A、D、G为CTL细胞培养前后CD3CD8表型变化图;B、E、H为CTL细胞培养前后CD4CD25表型变化图;C、F、I为CTL细胞培养前后⑶3⑶56表型变化图;K8法),A为直接提取的脐血MNC细胞,B为经过培养的CTL细胞;图6是实施例1诱导得到的CLT细胞内TNF-a、GM-CSF,IFN-y、granzymeA、granzymeB、GM-CSF、granulysin、perforin等相关细胞因子基因的表达,实体柱为扩增前结果,空白柱为扩增后结果。【具体实施方式】[0014]下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:实施例1:由脐血体外诱导培养CTL细胞(I)足月正常分娩之脐血取自山东大学齐鲁医院妇产科(产妇知情同意,并经山东大学齐鲁医院伦理委员会同意),用含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋收集,24h内实验。输血传播传染病检测合格的脐带血用Ficoll淋巴细胞分离液分离,用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞(MNC),待培养。[0015]第一阶段(第I天)在基础培养基中加入20ng/mL的GM-CSF,50ng/mL的Y-1FN,10ng/mL的IL-15,2ug/mL的PHA-P和100IU/mL的IL-4得到个性化培养基1,调整细胞密度为5X1O6个/mL,进行培养;第二阶段(第2-4天)在基础培养基中加入20ng/mL的SCF,20ng/mL的FLT-3L,50ng/mL的ant1-CD3,50ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基2,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第三阶段(第5-8天)在基础培养基中加入20ng/mL的SCF,20ng/mL的FLT-3L,IOng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基3,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第四阶段(第9-15天)在基础培养基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基4,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养,得到CTL细胞。[0016]上述细胞培养置于37°C、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。每隔I天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞免疫表型和活性。共培养15天后收获细胞。,增殖率平均为1522%。图1是CTL细胞形态学观察图,A:为培养前CTL细胞形态学观察(X200);B为培养后CTL细胞形态学观察,可见细胞聚集成克隆球(X200)。[0017]实施例2:由脐血体外诱导培养CTL细胞(I)足月正常分娩之脐血取自山东大学齐鲁医院妇产科(产妇知情同意,并经山东大学齐鲁医院伦理委员会同意),用含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋收集,24h内实验。输血传播传染病检测合格的脐带血用Ficoll淋巴细胞分离液分离,用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞(MNC),待培养。[0018]第一阶段(第I天)在基础培养基中加入10ng/mL的GM-CSF,10ng/mL的Y-1FN,5ng/mL的IL-15,lug/mL的PHA-P和10IU/mL的IL-4得到个性化培养基1,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第二阶段(第2-4天)在基础培养基中加入10ng/mL的SCF,10ng/mL的FLT-3L,IOng/mL的ant1-CD3,10ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基2,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第三阶段(第5-8天)在基础培养基中加入10ng/mL的SCF,10ng/mL的FLT-3L,5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基3,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第四阶段(第9-15天)在基础培养基中加入5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到个性化培养基4,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养,得到CTL细胞。[0019]上述细胞培养置于37°C、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养。每隔I天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞免疫表型和活性。共培养15天后收获细胞。,增殖率平均为493%。[0020]实施例3:由脐血体外诱导培养CTL细胞(I)足月正常分娩之脐血取自山东大学齐鲁医院妇产科(产妇知情同意,并经山东大学齐鲁医院伦理委员会同意),用含枸橼酸钠抗凝剂的采血袋收集,24h内实验。输血传播传染病检测合格的脐带血用Ficoll淋巴细胞分离液分离,用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞(MNC),待培养。[0021]第一阶段(第I天)在基础培养基中加入100ng/mL的GM-CSF,100ng/mL的Y-1FN,50ng/mL的IL-15,5ug/mL的PHA-P和500IU/mL的IL-4得到个性化培养基1,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第二阶段(第2-4天)在基础培养基中加入50ng/mL的SCF,50ng/mL的FLT-3L,IOOng/mL的ant1-CD3,100ng/mL的anti_CD28和2000IU/mL的IL-2到个性化培养基2,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第三阶段(第5-8天)在基础培养基中加入50ng/mL的SCF,50ng/mL的FLT-3L,50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到个性化培养基3,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养;第四阶段(第9-15天)在基础培养基中加入50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到个性化培养基4,调整细胞密度为5XIO6个/mL,进行培养,得到CTL细胞。