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一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法专利名称:一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法技术领域:本发明涉及一种9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的诱导合成方法,具体涉及一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法。背景技术:喜树碱(Camptothecin,CPT)是一种植物抗癌药物,它是从中国特有的珙桐科植物喜树中分离得到的一种天然五环生物碱。喜树碱是由Wall等于1966年首次从喜树皮中提取出来,随后人们的研究又逐步分离出10-羟基喜树碱、甲氧基喜树碱、10-甲氧基喜树碱等喜树碱衍生物。喜树碱通过嵌合抑制DNA拓扑异构酶I(TopoI)攻击肿瘤细胞,最终导致肿瘤细胞死亡,是理想的抗癌药物。喜树碱系列衍生物抗癌药物是附加值极高的高技术产品,对胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈癌、胃癌和血液肿瘤等均有效,加之可以口服,且对心、肺、肝、肾和神经毒性较小,已成为世界抗肿瘤药物市场上主要品种。提取喜树碱的原料主要有两种,一是喜树,二是臭马比木。从目前的研究情况和国内外的研究趋势来看,喜树碱及其衍生物主要是靠从喜树中分离获得,至今已从喜树中分离出来的30余种成分中,喜树碱及其衍生物已有10余种。喜树碱及衍生物的提取与分离主要是利用这些物质不溶于水而溶于乙醇、***仿等有机溶剂等方面的特性,通过分离提取,然后回收溶剂、结晶即可得到最终产品。但由于喜树的生长周期较长,通常要8-15年才能结果,喜树果中喜树碱的最高含量也只万分之几。此外,由于喜树主要分布在人为活动区,面临以毁林开田为目的的砍伐,优良的野生喜树资源较少,其相关的药用研究和开发也受到一定限制。臭马比木为茶茱萸科植物海桐假柴龙树(NothapodytesPittosporoides(Oliv.)sleum.)的根皮,其含有喜树碱(camptothecine)及喜树碱的甲氧基衍生物,臭马比木全株含有喜树碱,是喜树碱的另一个原料主要来源。臭马比木,名称青脆枝,学名Nothapodytesnimmoniana(Graham)Mablerley,原产地为兰屿,也属于茶茱萸科,分布我国于甘肃、湖北、湖南、广东、海南、广西、四川、贵州等地,臭马比木全株含有喜树碱。据植物提取产业信息网了解,臭马比木来源的99%喜树碱价格要比喜树来源的低一万元左右,价格上的优势使臭马比木成为了喜树碱提取的另一个关注热点。但是采用植物资源提取喜树碱及其衍生物,其周期较长,产量相对较低,所用的植物资源不能再生,严重的限制了喜树碱及其衍生物的生产,而全世界对喜树碱及其衍生物的需求量又非常大,为了解决这一矛盾,国内外学者都在不断的研究从其他的渠道来获取喜树碱及其衍生物,植物内生菌的研究也逐渐进入研究者的视线中。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物,被感染的宿主植物不表现出外在病症,可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其3内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物,也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物,这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来,植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注,从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来,该领域的研究已取得一定进展,发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。内生菌分为内生真菌、内生细菌、内生放线菌等。植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。近年来,植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有活性的次生代谢产物,在自然界中具有重要的生态学作用,引起了人们广泛的关注并取得很大进展。从微生物中寻找发现新型先导化合物,是新药研制的重要途径。内生菌作为微生物中的重要类群,其物种丰富,数量庞大,这为新药的研究和开发提供了巨大的资源库。最近一个全面的研究显示,51%的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物,而从土壤微生物发现的新物质仅为38%。由此可见,研究植物内生菌,寻找具有药物活性的次生代谢产物,是研发新型药物的重要途径,前景十分广阔。从紫杉树皮中分离出产生紫杉醇的内生真菌,进一步证实了“内共生理论”,即与宿主共同进化的内生真菌可能从宿主获得相关基因的直接传递,具有与宿主相同的次生代谢产物合成途径。因此近年来内生真菌已经成为筛选与宿主相同或相似的有益代谢产物的热点。主要从其中筛选一些抗生素类、抗肿瘤活性类、抗病毒类、杀虫活性类、植物生长调节剂类等等,甚至有抗氧化剂类、免疫抑制剂类、挥发性抗生素类、除草活性类等一些物质。微生物具有生长繁殖快,易培养,易控制、产量高,不受季节、气候、地域等自然条件的限制,发酵成本低,易于通过现代生物技术等改造遗传性状等优点,使得有望通过植物内生菌发酵为人类突破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制,为一些重要的药物生产开辟了新途径,因此具有极大的开发潜力和应用价值。目前已研究过的内生菌的药用植物至少有145种。喜树碱及其衍生物具有独特的抗癌机制,是目前世界上最理想的抗癌药物,主要用于治疗胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈癌、胃癌和血液肿瘤等,然而喜树碱科植物资源生长周期长、产量低,临床对喜树碱的需求量又十分巨大,形成了药源与需求的尖锐矛盾,为了改变药源紧缺的状况,国内外学者为从多渠道得到喜树碱做了大量的研究,包括化学合成、生物合成等,研究从喜树碱植物上分离出生产喜树碱的内生菌,为喜树碱及其他药物的内生菌发酵开辟了新途径。截止目前尽管已分离出多株产喜树碱的内生菌,但这些内生菌培养液中的喜树碱含量很低,远不能达到商业化生产的毫克级水平,因此迫切需要通过一定的途径提高内生菌喜树碱的产量。研究发现,改变内生菌的生长条件能够提高产量,如改变培养液的营养成分,特别是在发酵液中添加合成喜树碱的前提物或加入喜树碱提取物,寻找一些内生菌代谢调节剂,抑制其他的次生代谢途径,也可以提高喜树碱的产量,现代生物技术是提高内生菌产量更理想的途径,利用原生质体融合技术对内生菌进行遗传改造能大幅度提高喜树碱的含量,通过原生质体诱变,遗传转化,以及基因调控等分子手段也有望解决内生菌喜树碱产量低的问题。我国药用植物种类丰富,绝大多数为野生种类,由于其生长周期长、产量低、不可再生等限制,很难满足人类的需要。植物内生真菌次生代谢产物的多样性以及其他优点使其有望解决部分药物供不应求的现状。9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的抗癌活性超过喜树碱,对肝癌和头颈部癌也有明显疗效,而且副作用较少。可用于恶性肿瘤,银屑病,治疣,急慢性白血病以及血吸虫病引起的肝脾肿大等。所以利用植物内生菌的多样性,研究合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法有非常重要的意义和作用。发明内容本发明的目的是提供一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,采用该种方法,可以克服采用喜树或臭马比木提取喜树碱的原料来源周期长,产量低、原料不可再生的缺陷。为了解决上述问题,本发明所采用的技术方案是一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,包括如下步骤(1)菌悬液的制备将臭马比木内生菌置于PDA平板培养基中培养3、天,用接种环刮取菌落周边生长旺盛的菌丝体,接入装有玻璃珠的马铃薯蔗糖液体培养基中,253(TC摇床培养4(Γ50小时,转速为10(Tl50/min,用马铃薯蔗糖液体培养基稀释至菌体含量为10_4,得到菌悬液;(2)人工诱变在菌悬液中加入浓度为21500M的诱导剂,培养Γ7天,再次加入诱导剂,^,培养3飞天,接种于PDA平板培养基中,筛选出合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱量高的菌株。上述的诱导剂为非生物诱导剂。本发明的有益效果是本发明采用人工诱导臭马比内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱,可以克服原料来源周期长,产量低、原料不可再生的缺陷,生产成本低,生产过程中的环境污染程度低,对生产人员的毒害小,产品收率高,纯度高。具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,这些实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围。实施例1一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,包括如下步骤(1)菌悬液的制备将臭马比木内生菌置于PDA平板培养基中培养3天,用接种环刮取菌落周边生长旺盛的菌丝体,接入装有玻璃珠的马铃薯蔗糖液体培养基中,25°C摇床培养50小时,转速为lOOmin,用马铃薯蔗糖液体培养基稀释至菌体含量为10_4,得到菌悬液;(2)人工诱变在菌悬液中加入浓度为2M的诱导剂,培养4天,再次加入诱导剂,,培养5天,接种于PDA平板培养基中,筛选出合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱量高的菌株,然后进行发酵,提取获得9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱。实施例2一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,包括如下步骤(1)菌悬液的制备将臭马比木内生菌置于PDA平板培养基中培养4天,用接种环刮取菌落周边生长旺盛的菌丝体,接入装有玻璃珠的马铃薯蔗糖液体培养基中,30°C摇床培养40小时,转速为150min,用马铃薯蔗糖液体培养基稀释至菌体含量为10_4,得到菌悬液;(2)人工诱变在菌悬液中加入浓度为1500M的诱导剂,培养7天,再次加入诱导剂,,培养5天,接种于PDA平板培养基中,筛选出合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱量高的菌株,然后进行发酵,提取获得9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱。实施例3一种人工诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,包括如下步骤(1)菌悬液的制备将臭马比木内生菌置于PDA平板培养基中培养4天,用接种环刮取菌落周边生长旺盛的菌丝体,接入装有玻璃珠的马铃薯蔗糖液体培养基中,观摇床培养45小时,转速为130min,用马铃薯蔗糖液体培养基稀释至菌体含量为10_4,得到菌悬液;(2)人工诱变在菌悬液中加入浓度为1000M的诱导剂,培养6天,再次加入诱导剂,,培养4天,接种于PDA平板培养基中,筛选出合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱量高的菌株,然后进行发酵培养,提取获得9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱。-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,其特征在于包括如下步骤(1)菌悬液的制备将臭马比木内生菌置于PDA平板培养基中培养3、天,用接种环刮取菌落周边生长旺盛的菌丝体,接入装有玻璃珠的马铃薯蔗糖液体培养基中,253(TC摇床培养4(Γ50小时,转速为10(Tl50/min,用马铃薯蔗糖液体培养基稀释至菌体含量为10_4,得到菌悬液;(2)人工诱变在菌悬液中加入浓度为21500μM的诱导剂,培养Γ7天,再次加入诱导剂,^,培养3飞天,接种于PDA平板培养基中,筛选出合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱量高的菌株。-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,其特征在于所述的诱导剂为非生物诱导剂。全文摘要本发明涉及一种诱导臭马比木内生菌合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱的方法,该方法是将臭马比木内生菌置于PDA平板培养基中培养3~4天,用接种环刮取菌落周边生长旺盛的菌丝体,接入装有玻璃珠的马铃薯蔗糖液体培养基中,用马铃薯蔗糖液体培养基稀释至菌体含量为10-4,得到菌悬液,在菌悬液中加入浓度为2~1500μM的诱导剂,培养4~7天,再次加入诱导剂,~,培养3~5天,接种于PDA平板培养基中,筛选出合成9-甲氧基-18,19-脱氢喜树碱量高的菌株,然后进行发酵,用超声波提取,该方法生产成本低,生产过程中的环境污染程度低,对生产人员的毒害小,产品收率高,纯度高。

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