一种可控丝素颗粒的制备方法.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种可控丝素颗粒的制备方法一种可控丝素颗粒的制备方法本发明公开了一种可控丝素颗粒的制备方法,该方法步骤为:将茧片脱胶得到丝素,将丝素溶解、透析制备丝素蛋白溶液,利用弹性蛋白酶特异性酶解作用酶解丝素蛋白溶液,然后将酶解后的丝素蛋白溶液加入磷酸缓冲液中,充分搅拌后静置,分离,将沉淀物洗净干燥,得到丝素颗粒。该方法从分子量的角度控制粒径大小,生产的颗粒粒径小,通过改变酶解时间及其他条件,可以控制粒径的大小,且生产过程没有使用有毒有害试剂,丝素颗粒安全、无毒副作用,过程简单、易得,产品可广泛应用于药品、化妆品等领域。【专利说明】—种可控丝素颗粒的制备方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种丝素颗粒的制备方法,更具体说涉及一种丝素颗粒纳微结构可控的制备方法。【背景技术】[0002]蚕丝由于其特殊的光泽、透气性好、吸湿性强、手感好同时兼具高强度等优点被誉为“纤维皇后”,一直应用于纺织领域。丝素蛋白是蚕丝最主要的组成部分,由于其无毒、无害和无免疫反应,且具有优异的生物相容性、可生物降解性和透气透氧性而广泛应用在酶固定化材料、氧气通透膜、组织工程以及药物缓释材料等方面。国内外已经取得的一系列研究成果显示其在生物医药领域的巨大应用潜力。近年来随着丝素蛋白独特氨基酸成分及结晶结构等理化性能的深入研究,尤其是蚕丝多用途开发向高新技术的渗透,国内外对丝素蛋白的应用正从传统的纺织领域积极向生物医药、化妆品、食品等领域拓展。[0003]随着人们生活生平的日益提高,人们对化妆品和保健品的要求日渐趋向于天然、低碳、环保、营养、低刺激或无刺激性。基于此,有关天然蚕丝蛋白及其衍生物的用途方面的应用研究也日益获得广泛关注。组成丝素蛋白的氨基酸主要有丙氨酸(可降低血液中的胆固醇)、甘氨酸(可促进乙醇的代谢)、络氨酸和丝氨酸(可抵抗紫外线辐射)等,有资料显示,丝素蛋白IOs左右就可被人体细胞吸收,还能吸收紫外线,具有抵御日光辐射的作用,但是丝素蛋白由于蛋白分子间和分子内存在大量的氢键作用而紧密结合,较难溶于水,使其难以直接用于化妆品和保健药品。而丝素多肽由于具有相对分子质量小的特点,相比较易于溶于水,据报道,其能抑制黑色素的生成,尤其可应用于美白产品的化妆品。故将丝素蛋白酶解成多肽,不仅在化妆品和保健品领域有更广泛的应用前景,而且也会促进丝素在其他领域的开发和利用。[0004]目前已有不少制备丝素蛋白纳微颗粒相关的研究,主要的制备方法有相分离法、盐析法、反相微乳法和电喷法。相分离法主要是将丝素蛋白与聚乙烯醇混合,经震荡处理后,形成蛋白颗粒溶液,冷冻干燥或者空气干燥,除去聚乙烯醇即得丝素蛋白纳米颗粒;盐析法是将丝素蛋白溶液与无机盐混合,低温处理,析出丝素颗粒,是利用盐的加入使蛋白质表面电荷被中和以及水合I吴被破坏,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性而沉淀析出;反相微乳法是将丝素蛋白溶液利用超声震荡分散在多元醇中,形成不溶于水纳米液滴,之后加入高吸水性树脂,使丝素蛋白在微乳液的状态下干燥固化,得到不溶于水的纳米丝素蛋白球;电喷法是以蛋白水溶液为原理,采用高压静电喷射装置喷射形成蛋白微液滴,然后通过有机溶剂诱导形成不溶于水的β-折叠结构,从而制得纳米蛋白微球。从上述可以看到,相分离法、反相微乳法以及电喷法制备颗粒是通过超声震荡或者喷射形成液滴的大小决定形成的丝素颗粒大小,包括盐析法在内,都是以蛋白质大分子为基础形成颗粒,形成的颗粒多为微米级,颗粒直径难于控制,颗粒大小差异大,分布不均。发明内容[0005]本发明目的是解决现有技术的不足,提供一种丝素颗粒可控的制备方法。该方法中采用的弹性蛋白酶可特异性地酶解含有丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)和缬氨酸(Val)的蛋白,丝素蛋白中的基本的氨基酸链段即为GIy-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser和GIy-Ala-Gly-Ala-Gly-Y(Y为如酪氨酸等氨基酸),故弹性蛋白酶具有优异的酶解丝素蛋白的能力。本方法利用弹性蛋白酶这种特异性地酶解作用,从分子量的角度控制粒径大小,生产的颗粒粒径小,分布均匀。且本发明方法中没使用有毒有害试剂,产生的丝素颗粒安全、无毒副作用,生成过程简单、易得,产品可广泛应用于药品、化妆品等领域。[0006]本发明的技术方案是:将茧片脱胶,用水洗净干燥,得到纯净的丝素,将所得的丝素溶解,透析,得到丝素蛋白溶液,调节丝素蛋白溶液的浓度至1%~2%,~,%~%以及浓度为3~6mg/mL的弹性蛋白酶溶液,在35~55°C下酶解5~180min后,100°C~120°C高温使酶失活,得到特定分子量分布的丝素蛋白溶液,~,-,充分搅拌混合,之后室温下静置12小时或12小时以上,去除上清液,沉淀物用水洗净干燥,得到丝素颗粒。[0007]进一步:优选的,%碳酸氢钠溶液中煮沸45~60min脱胶,%碳酸钠溶液中煮沸50~60min脱胶,重复脱胶2~3次;[0008]更进一步:优选的,°C烘箱中溶解lh,或取CaCl2与乙醇、水按摩尔比1:2:8配制溶剂,丝素在溶剂中70°C~74°C下溶解lh,或在98°C~100°C下溶解IOmin。[0009]更进一步,优选的,弹性蛋白酶失活的温度范围为100°C~120°C。[0010]本发明的优点是制备的丝素颗粒粒径可控。该方法利用弹性蛋白酶特异性地酶解作用,从分子量的角度控制粒径大小,生产的颗粒粒径小,分布均匀。且本方法没使用有毒有害试剂,产生的丝素颗粒安全、无毒副作用,生成过程简单、易得,产品可广泛应用于药品、化妆品等领域。【专利附图】【附图说明】[0011]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:[0012]图1为对比例的丝素蛋白溶液和实施例1-3酶解后的丝素蛋白溶液蛋白电泳图的对比图;[0013]其中marker为分子量为5_250kDa的标准蛋白的电泳图;a、b、C、d分别对应为对比例、实施例1、实施例2、实施例3的丝素蛋白溶液;[0014]图2为对比例得到的丝素颗粒的扫描电镜照片;[0015]图3为对比例得到的丝素颗粒的粒径分布图;[0016]图4为实施例1得到的丝素颗粒的扫描电镜照片;[0017]图5为实施例1得到的丝素颗粒的粒径分布图;[0018]图6为实施例2得到的丝素颗粒的扫描电镜照片;[0019]图7为实施例2得到的丝素颗粒的粒径分布图;[0020]图8为实施例3得到的丝素颗粒的扫描电镜照片。【具体实施方式】[0021]以下结合对比例和实施例具体对本发明进行说明。[0022]对比例:[0023]包括如下步骤:[0024](I)丝素的制备:取去离子水2L,加入IOg碳酸氢钠,煮沸后加入IOg茧片,煮45min,然后用去离子水洗3_4次,自然晾干,获得脱胶后的丝素;[0025](2)丝素蛋白溶液的制备:将上述步骤(1)°C烘箱中溶解I小时,用截留分子量为6000-8000的透析袋透析3天,得到丝素蛋白溶液,如图1中lanea为所得丝素蛋白溶液电泳图,从中可以看出该溶液中蛋白分子量主要分布在20-350kDa范围;[0026](3)丝素颗粒的制备:将上述步骤(2),pH=,然后在室温下静置12小时,之后再将溶液以6000rpm的速度离心洗涤,弃去上清液,沉淀物用去离子水洗涤2_3次,得到丝素颗粒。[0027]从图2所示的丝素颗粒扫描电镜照片可以看出,丝素颗粒为球状,表面光滑,分散性较好,颗粒之间的粘连较少。如图3所示,丝素颗粒粒径分布图可以看出,±。[0028]实施例1:[0029]本实施例包括如下步骤:[0030](I)丝素的制备:取去离子水2L,加入IOg碳酸氢钠,煮沸后加入IOg茧片,煮45min,然后用去离子水洗3_4次,自然晾干,获得脱胶后的丝素;[0031](2)丝素蛋白溶液的制备:将上述步骤(1)°C烘箱中溶解I小时,用截留分子量为6,000-8,000的透析袋透析3天,得到丝素蛋白溶液;[0032](3)特定分子量分布的丝素蛋白溶液的制备:将上述步骤(2)%,,取8mL丝素溶液预热lOmin,%,浓度为5mg/mL弹性蛋白酶溶液(体积为90μI),预热5min,然后将弹性蛋白酶加入到预热后的丝素溶液中,在37°C下酶解lOmin,100°C~120°C高温使酶失活,得到特定分子量分布丝素蛋白溶液。如图1中Laneb所示为本步骤得到的丝素蛋白溶液蛋白电泳图。从图中可以看出,该溶液中蛋白分子量主要分布在15-70kDa范围;[0033](4)丝素颗粒的制备:将上述步骤(3),pH=,然后在室温下静置12小时,之后再将溶液以6000rpm的速度离心洗涤,弃去上清液,沉淀物用去离子水洗涤2_3次,得到丝素颗粒。[0034]从图4所示本实施例丝素颗粒扫描电镜照片可以看出,丝素颗粒呈球状,表面较光滑,而且颗粒之间的粘连较少。如图5所示,丝素颗粒粒径分布图可以看出,±。[0035]实施例2[0036]本实施例步骤⑴和步骤⑵同实施例1。[0037](3)特定分子量分布的丝素蛋白溶液的制备:将步骤(2)%,,取8mL丝素溶液预热lOmin,%,浓度为5mg/mL的弹性蛋白酶溶液(体积为90μI),然后将弹性蛋白酶加入到预热后的丝素溶液中,在37°C下酶解20min,100°C~120°C高温使酶失活。得到特定分子量分布的丝素蛋白溶液。如图1中Lanec所示为本步骤得到的丝素蛋白溶液蛋白电泳图。从图中可以看出,该溶液中蛋白分子量主要分布在15-40kDa范围;[0038](4)丝素颗粒的制备:步骤(3),pH=,混合搅拌5min,然后在室温下静置12小时。将溶液以6000rpm的速度离心洗涤,弃去上清液,沉淀物用去离子水洗涤2-3次,得到丝素颗粒。[0039]从图6所示本实施例丝素颗粒扫描电镜照片可以看出,丝素颗粒基本呈球状,表面较粗糙,颗粒之间粘连严重。如图7所示,丝素颗粒粒径分布图可以看出,±。[0040]实施例3[0041]本实施例步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)同实施例2。[0042](3)特定分子量分布的丝素蛋白溶液的制备:将步骤(2)%,,取8mL丝素溶液预热lOmin,%的,浓度为5mg/mL的弹性蛋白酶溶液(体积为90μI),然后将弹性蛋白酶加入到预热后的丝素溶液中,在45°C下酶解45min,100°C~120°C高温使酶失活。特定分子量分布的丝素蛋白溶液。如图1中Laned所示为本步骤得到的丝素蛋白溶液中蛋白电泳图。从图中可以看出,该溶液中蛋白分子量分布在小于20kDa的范围;[0043]从图8所示本实施例得到的丝素颗粒扫描电镜照片可以看出,丝素颗粒基本呈多孔膜状。[0044]从上述实施例可以看出,本发明方法一种丝素颗粒可控的制备方法,该方法利用弹性蛋白酶特异性地酶解作用,通过调节酶解时间及其他酶解条件,控制丝素蛋白分子量分布,从分子量的角度控制粒径大小,生产的颗粒粒径小,分布均匀。且本方法没使用有毒有害试剂,产生的丝素颗粒安全、无毒副作用,生成过程简单、易得,产品可广泛应用于药品、化妆品等领域。【权利要求】,其特征在于包括如下步骤:(1)将茧片进行脱胶,洗净干燥,得到纯净丝素;(2)将上述步骤(1)所得的丝素溶解、透析,得到丝素蛋白溶液;(3)调节上述步骤(2)得到的丝素蛋白溶液的浓度至I%~2%,~,%~%以及浓度为3~6mg/mL的弹性蛋白酶溶液,在35~55°C下酶解5~180min后,高温使酶失活,得到特定分子量分布的丝素蛋白溶液;(4)将上述步骤(3)~,-,充分搅拌混合,之后室温下静置12小时或12小时以上,去除上清液,沉淀物用水洗净干燥,得到丝素颗粒。,其特征在于,上述步骤(1)中茧片脱胶可以采取以下方式中的任意一种:a、%碳酸氢钠溶液中煮沸45~60min脱胶;b、%碳酸钠溶液中煮沸50~60min脱胶,重复脱胶2~3次。,其特征在于,上述步骤(2)中丝素溶解可以采用以下方式中的任