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一种寡核苷酸芯片探针的设计方法和hiv寡核苷酸探针及其质量控制方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种寡核苷酸芯片探针的设计方法和hiv寡核苷酸探针及其质量控制方法专利名称:一种寡核苷酸芯片探针的设计方法和hiv寡核苷酸探针及其质量控制方法技术领域:本发明涉及生物化学领域,具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。背景技术:寡核苷酸(oligo)生物芯片采用的寡核苷酸(oligo)探针通常大于lOmer,如用于基因分型的20mer左右的单核苷酸多态性(SNP)探针,以及目前较流行的长链oligo探针(50、60、70mer),这种类型芯片可根据已知序列快速设计探针制备芯片,且其检测的特异性高,因而目前在病原体的检测和分型以及基因表达谱研究等领域中具有广泛的应用前景。人免疫缺陷病毒寡核苷酸生物芯片的稳定性即芯片制备的质量控制是首要的关键问题。基因芯片制备的质量控制包括基因芯片探针制备的质量控制,支持物制备的质量控制,探针在支持物上固定的质量控制。其中前两者的质量控制采用常规方法即易于控制,而探针在支持物上固定的质控则有多种不同方法的选择。①一种方法是利用荧光DNA染料,二聚体的青色素核酸染料对核酸表现出很高的亲和力,用这些染料对探针染色,可以根据荧光的强度来估计芯片的质量;②另一种较常用的方法是利用荧光分子(如Cy3或Cy5)标记的9mer随机引物与芯片杂交。理论上,随机引物中可能含有能与探针中某一段或几段序列互补配对的组分,这样就可以利用它们杂交后的荧光强度来评价芯片的质量;但是由于随机引物中能与探针杂交的组分相对较少或浓度低,所以杂交的效率和敏感性可能会低很多;③还有一种方法是芯片探针采用一种混合物,混合物中包含靶基因探针和另一种已荧光标记的特异寡核苷酸。通过检测混合物中这段特异寡核苷酸的荧光信号来间接评价靶基因探针的固定效率。但这种方法由于所有探针溶液中都要加荧光标记的寡核苷酸,大大增加了芯片的成本。由于传统的寡核苷酸探针设计仅针对待检测的靶基因,以上这些方法,都无法直接、有效地评价芯片制备的质量。因此,需要设计一种包含有质量控制信息的新型人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针,并建立一种高效、灵敏的人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质量控制方法。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种寡核苷酸探针的设计方法。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针。本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质量控制的方法。本发明解决上述问题的技术方案具体是一种寡核苷酸探针的设计方法,该方法包括以下步骤(1)设计靶基因寡核苷酸探针针对靶基因,;(2),依据寡核苷酸探针的设计原则设计出长度为IOmer的通用序列;所述通用序列与步骤1所获得的靶基因寡核苷酸探针同源性不大于40%;(3)构建寡核苷酸探针将步骤2所获得的通用序列分别连接在步骤1所获得的靶基因寡核苷酸探针的两端构建出寡核苷酸探针;其中,所述的寡核苷酸探针的设计原则是①Tm值在89士4°C;②GC含量为40%60%;③重复的单一碱基连续不超过6个;④探针分子最稳定二级结构配对碱基长度少于6bp;⑤探针内部发夹结构不超过4个。采用上述的寡核苷酸探针的设计方法构建的一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针,该探针由以下序列的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针和序列为5’-TATGACTCAG-3’T;其中,所述的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针的两头分别连接一段所述的通用序列。本发明所述的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针可以由本领域常用的方法合成,如,利用DNA合成仪合成。一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质量的控制方法,该方法包括以下步骤首先制备含有上述人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针的寡核苷酸芯片,然后对序列为5’-TATGACTCAG-3’的通用序列的互补序列进行荧光标记,最后将荧光标记的互补序列与所制得的寡核苷酸芯片杂交,用芯片扫描仪扫描寡核苷酸芯片,分析芯片上各点的荧光强度,计算荧光强度大于3000的探针比例,如果荧光强度大于3000的探针比例大于等于95%,则判断芯片质量合格。本发明所述的一种人免疫缺陷病毒寡核苷酸芯片质量的控制方法中,荧光标记的互补序列为5’-荧光分子-ATACTGAGTC-3’。本发明所述的荧光分子可以是Cy3、Cy5、生物素等,最好是Cy3。其中Cy3是Cy3-N-羟基琥珀酰亚***酯。本发明所述的荧光标记的互补序列也可以由本领域常用的方法合成,如,利用DNA合成仪合成。采用本发明所述的寡核苷酸探针的设计方法可设计含有通用序列的各种具体基因的寡核苷酸探针,该探针与荧光标记的通用序列的互补序列杂交,具有较高的敏感性和效率,可用于含有相应基因的寡核苷酸探针的生物芯片的质量控制。本发明的生物芯片质量控制方法与现有方法相比具有显著的优势。由于设计的新型寡核苷酸探针含有通用序列,相同的低浓度条件下,荧光标记的互补序列与本发明获得的寡核苷酸探针进行杂交时显示出的效率及敏感性高于荧光标记的随机引物与本发明获得的寡核苷酸探针进行杂交时显示出来的效率和敏感性。本发明的芯片质量控制方法尤其适合临床病原体基因的检测芯片设计。下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1是HIV寡核苷酸芯片质量控制方法比较的杂交结果,其中A、B、C:Cy3标记的互补序歹Ij;D、E、F:Cy3标记的9mer的随机引物;A、D:10ymol/L;B、E:lymol/L;C、(HIV-I)寡核苷酸探针,其制备的方法和过程如下所述1、首先,从GenBank数据库获取人免疫缺陷病毒(HIV-I)B亚型U26942的cDNA全长序列,通过BLAST分析获得HIV病毒的保守性序列,-IB亚型U26942保守序列逐一进行分析,依据寡核苷酸探针的设计原则设计出长度为50mer的Oligo探针,T;2、然后,,依据寡核苷酸探针的设计原则设计出长度为IOmer的通用序列5,-TATGACTCAG-3,,其中通用序列与HIV靶基因探针同源性为40%。3、最后,在该HIV靶基因探针两端加上上述通用序列,得到人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针,。其序列为SEQIDNO:1,探针的参数如下GC%%;°C;发夹结构3个,二聚体3个;符合探针设计的原则。上述步骤1和2中,所述的寡核苷酸探针的设计原则为①Tm值在89士4°C;②GC含量为40%60%;③重复的单一碱基连续不超过6个;④探针分子最稳定二级结构配对碱基长度少于6bp;⑤探针内部发夹结构不超过4个。上述步骤中,、分析探针的操作过程如下(1);点击file,newsequence,输入序列;(2)ept/ept;(3)点击Change中的currentoligo,输入需要设计寡核苷酸链的长度——50mer;(4)点击Analysis,分另Ij选择duplexformation、positionandTm中的entiresequence,保留Meltingtemperature窗口,将其他窗口全部关闭。(5)点击Tm窗口,用箭头逐个移动所需序列,其他窗口顺序显示每段序列所对应的各项参数值(Tm值、GC含量、发夹结构、二聚体)。根据探针设计原则中各参数的要求选择探针,以保证探针在杂交时的反应条件比较一致。(6)将所选择探针的序列输入NCBI网站BLASTn的EnterQuerySequence,在ChooseSearchSet中,选择database中的others,并除去HIV(excludeHIV);(7)点击BLAST,进行比对;(8)比对结果中,若该探针与非HIV基因序列Score分值高于40则弃用,确保探针的特异性。例2本例为例1所得到的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针在对人免疫缺陷病毒芯片进5行质量控制上的应用。首先,利用DNA合成仪合成例1所得到的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针,将其溶解于点样液中,调整终浓度为1μg/μ,并转移到384孔板中备用。运用CartesianPixSys5500基因芯片点样仪,将上述探针以及空白对照打印在Corning公司的环氧基包被的玻片上,其中每行打印6个探针点,第3、6行打印空白对照,制备获得生物芯片,上述点样液是Pronto!epoxidespottingsolution,使用点样液作为空白对照液,空白对照的信号可代表芯片的点样过程及点样液的污染情况。然后,合成结构为5’-荧光分子-ATACTGAGTC-3,的Cy3标记的互补序列,将其溶解在2X杂交缓冲液中,获得浓度分别为10ymOl/L、lymOl/L、;将Cy3标记的9mer的随机引物溶解在2X杂交缓冲液中,获得浓度分别为10μmol/L、1μmol/L、;取3μ1互补序列杂交溶液、随机引物杂交溶液分别加入到上述制备好的生物芯片上,置于杂交盒中30°C下杂交4h,其中杂交缓冲溶液组成为50%甲酰***、10父55(、%SDS0杂交后先用2XSSC、%SDS洗脱掉盖玻片,再用2XSSC、%SDS洗脱5min;、%SDS洗脱5min,重复两次;,重复五次;氮气吹干。用Gen印ix4000B扫描生物芯片,杂交结果如图1所示。。如图1所示,较高浓度即10μmol/L时两者的杂交效果基本相当(图1A、D)芯片上所有探针点的荧光强度均大于3000,合格探针的比例为100%,表明芯片制备质量合格。空白对照无杂交信号,表明点样液及点样过程无污染。而较低浓度时,即lymol/L、,其中1μmol/L的Cy3-互补序列杂交信号与10μmol/L的Cy3标记的互补序列杂交信号基本相当,也就是说采用比Cy3标记的9mer的随机引物浓度低十倍的Cy3标记的互补序列即可高效、灵敏地检测寡核苷酸芯片的制备质量。权利要求一种寡核苷酸探针的设计方法,该方法包括以下步骤(1)设计靶基因寡核苷酸探针针对靶基因,,依据寡核苷酸探针的设计原则设计出长度为50mer的靶基因寡核苷酸探针;(2),依据寡核苷酸探针的设计原则设计出长度为10mer的通用序列;所述通用序列与步骤1所获得的靶基因寡核苷酸探针的同源性不大于40%;(3)构建寡核苷酸探针将步骤2获得的通用序列分别连接在步骤1所获得的靶基因寡核苷酸探针的两端,构建新型寡核苷酸探针;其中,所述的寡核苷酸探针的设计原则是①Tm值在89±4℃;②GC含量为40%~60%;③重复的单一碱基连续不超过6个;④探针分子最稳定二级结构配对碱基长度少于6bp;⑤探针内部发夹结构不超过4个。,该探针由以下序列的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针和序列为5,-TATGACTCAG-3,T;其中,所述的人免疫缺陷病毒的靶基因寡核苷酸探针的两头分别连接一段所述的通用序列。,该方法包括以下步骤首先制备含有权利要求2所述的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针的寡核苷酸芯片,然后对权利要求2所述的通用序列的互补序列进行荧光标记,最后将荧光标记的互补序列与所制得的寡核苷酸芯片杂交,并用芯片扫描仪扫描寡核苷酸芯片,分析芯片上各点的荧光强度,计算荧光强度大于3000的探针比例,如果荧光强度大于3000的探针比例大于等于95%,则判断芯片质量合格;其中荧光标记的互补序列为5’-荧光分子-ATACTGAGTC-3’。,其特征是荧光分子是Cy3-N-羟基琥珀酰亚***酯。全文摘要本发明属于生物技术领域,涉及包含核酸的检测方法,具体涉及一种寡核苷酸探针设计方法。本发明所述的寡核苷酸探针设计方法包括以下步骤(1)针对靶基因,设计出长度为50mer的靶基因寡核苷酸探针;(2)设计出与靶基因同源性不大于40%的长度为10mer的通用序列;(3)将通用序列分别连接在靶基因寡核苷酸探针的两端构建出寡核苷酸探针。采用本发明所述的设计方法构建的人免疫缺陷病毒寡核苷酸探针,其序列为SEQIDNO1。对本发明获得的通用序列的互补序列进行荧光标记得到荧光标记的互补序列。荧光标记的互补序列可以用来检测寡核苷酸芯片质量,具有灵敏度高的优点,尤其适合临床病原体基因的检测芯片设计。

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