南京农业大学考研生化试验.pdf

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..实验一缓冲液配制和pH值测定实验二荧光光度法测定核黄素的含量实验三茚三***比色法测定赖氨酸含量实验四考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量实验五2,6-二***酚靛酚滴定法测定L-。掌握配制缓冲液和使用pH计的基本方法。,能够自动调整和保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。以HAc和NaAc组成的缓冲液为例,它的pH符合下面关系:pH=pKa?lg[HAc]/[Ac?],因此改变[HAc]/[Ac?]的比值,可以在一定范围内配制不同pH值的缓冲液。缓冲液的缓冲容量大小不仅与其总浓度有关,而且与其组分比也有关。总浓度越大,缓冲容量越大;总浓度一定,其组分浓度比越接近1,缓冲容量越大。缓冲液适当稀释或浓缩,其pH值基本保持不变。测定pH值的pH计(或称酸度计),一般是由一支对H+敏感的玻璃电极和一支不随溶液中被测离子活度变化而改变其本身电位的甘***电极以及一个测量电位的电位计所组成,两支电极和测试溶液构成一个伏特电池,电极在不同的pH值溶液中产生不同的电位,它符合电化学理论中的Nernst方程,即E=E0?()pH。测定中,首先测得已知pH的标准缓冲液中产生的电位Es,然后,由测得未知pH缓冲液中产生的电位Ex通过公式可直接算出该缓冲液的pH(pHx)。为了方便,pH计上装有一个定位调节器,当测量标准缓冲液pH时,利用它可把读数直接指示在标准的pH值上,这样在以后测未知pH的缓冲液时,该电位读数也就直接表示相应的pH值。在本实验使用的Beckman?61pH计计中,以上过程均由仪器自动完成。(NaHPO·12HO)、磷酸二氢钠(NaHPO·2HO)242242冰醋酸、醋酸钠(NaAc·3HO)、三羟***氨基甲烷(Tris)2甘氨酸、盐酸、标准pH缓冲液(、、)():100mL×2量筒:50mL×1移液管:10mL×1烧杯:100mL?1200mL?2:..漏斗、洗瓶、洗耳球、移液管架、玻棒:-磷酸二氢钠缓冲液配制(,)(1)由附录“常用缓冲溶液的配制”表中通过计算,分别称取NaHPO·12HOg,NaHPO·2HOg,用蒸馏水溶解后,定容至100mL。242242(2)将配好的缓冲液倒入试剂瓶,贴上标签,保存备用。-醋酸钠缓冲液配制(,)(1):称取NaAc·3HOg,用蒸馏水溶解后,定容至50mL。2(2):吸取冰醋酸mL,用蒸馏水定容至1000mL。(3),,于烧杯中混匀,用pH计测定pH值,。(4)将配制好的缓冲液倒入试剂瓶,贴上标签,保存备用。-Gly-HCl缓冲液配制(,)(1)称取三羟***氨基甲烷(Tris),,加入80mL蒸馏水,加热溶解。(2)冷却后,用pH计测定pH值,,。(3)用蒸馏水定容至100mL。(4)将配制好的缓冲液倒入试剂瓶,贴上标签,,选取合适的缓冲试剂,主要根据什么原则?,常用的方法有哪几种?。学****荧光光度计的操作和使用。(维生素B2)是一种异咯嗪衍生物,它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐等还原成无色的二氢化物,同时会失去荧光,因而检测样品时要防止荧光的衰减。二氢化物在空气中易重新氧化,恢复其荧光,其反应如下:图2核黄素氧化还原机理图:..核黄素的激发光波长范围约为440—500nm(一般为440nm),发射光波长范围约为510—550nm(一般为520nm)。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比,可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。注意:在所有的操作过程中,要避免核黄素受阳光直接照射。():25mL×10容量瓶:100mL×2(棕色)移液管:10mL×15mL×11mL×1烧杯:50mL×2250mL×1滤纸:f11cm滴管:2支坐标纸、研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒:(5μg/mL)准确称取核黄素10mg,,置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温,用蒸馏水定容至2000mL。转入棕色瓶中。(1)取样:取核黄素药片一粒,称重g;转入研钵中磨成粉。(2)定容:,用蒸馏水定容至100mL。(3)过滤:收集部分滤液于试管中。(4)稀释:取滤液2mL于棕色容量瓶中,定容100mL,待测。(本实验由于样品溶解后所剩残渣很少,残渣所占体积对定容体积100mL造成的误差可以忽略不计,所以采用先定容,后过滤操作过程,这样可以节省时间。),按下表所示顺序操作。注意:在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%,则需要再行稀释,并记录稀释倍数或调节灵敏度。~6号管的数据,以核黄素含量(mg)为横坐标,F值(F1-F2)为纵坐标,在坐标纸上绘制标准曲线;;(μg);:..(单位用μg/g鲜重)。,需要避光操作?附注(荧光光光度计使用说明)使用930型荧光光度计时:核黄素荧光测定的激发光波长为440nm,发射光波为520nm。因此可选用带通型400nm(蓝字)滤色片为激发光滤色片,选用截止型510nm(红字)滤色片为发射光滤色片。待仪器预热并调好零点后,用参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度(100%),然后分别测定其它溶液的相对荧光强度F值。使用F96型荧光光度计时:需用“0”管的溶液调F=,再分别测定其它的中溶液的F值。。掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。-NH2,它与茚三***起颜色反应呈蓝紫色,在波长570nm处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同,它仅有的一个氨基(a-NH2)相当于蛋白质中赖氨酸残基上的e-NH2,因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比(:1)。式中W:样品质量C:样品中游离氨基酸的量,各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是:玉米:%,高粱:%,水稻:%,小麦:%X::25mL×11移液管:1mL×12mL×220mL×1烧杯:250mL×250mL×1滴管:2洗耳球:2滤纸:f11cm研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:(,)(参见附录二)***试剂称3g茚三***溶于100mL95%乙醇中,溶解后加入160mg二***化锡,搅拌溶解后加入100mL柠檬酸缓冲液中,搅匀备用。(50mg/mL)准确称取5mg亮氨酸,用蒸馏水稀释定容到100mL,则得浓度为50mg/mL的标准液。(1)取材:称取烘干、粉碎(过80目筛)(油料种子须经脱脂处理)。(2)提取:将称取的样品放入试管,准确加入20mL蒸馏水,摇匀。读取样品悬液的总体积mL,置于80℃恒温水浴中提取20min。(可间歇摇动)(3)定容:冷却后,用蒸馏水将试管中悬液定容至(2)中悬液总体积刻度mL,,即最终样品液总定容体积仍为20mL,摇匀。:..(4)过滤:将提取液用滤纸过滤,收集滤液作为待测样(滤纸不能用蒸馏水湿润)。,按下表所示顺序操作。~6号管的数据,以亮氨酸含量(mg)为横坐标,A570为纵坐标,在坐标纸上绘制标准曲线;;(mg);(单位用mg/mg样重)。,计算样品中赖氨酸的百分含量?,为什么对样品要进行脱脂处理?。-250法测定蛋白质含量的原理和方法。-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料,其结构如下图。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物,其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡,生成的复合物在1小时内保持稳定。在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏,蛋白质最低检测量:..为5mg,而且此法操作简便、快速,干扰物质少,是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差,每次更换检测样液时,应及时用乙醇洗涤比色皿,再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。:25mL×9刻度试管:10mL×1移液管:1mL×320mL×1烧杯:250mL×250mL×1离心管:10mL×1滴管:2洗耳球:2坐标纸研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:(BSA)标准液(100mg/mL)精确称取10mg牛血清白蛋白,用蒸馏水溶解后定容至100mL。--250,溶于50mL95%的乙醇中,加入100mL85%的正磷酸,再用蒸馏水定容到1000mL。过滤待用。该试剂于常温下可保存1个月。(1)取材:,准确记录其质量g。(2)研磨:将样品置于研钵中,研磨成匀浆后,准确加20mL蒸馏水。(3)提取:将上述匀浆液在研钵内浸提10分钟,不断搅拌,使蛋白质充分溶解在水中(注意,已定容,所以在没搅匀之前不能损失样液)。(4)离心:将部分浸提液转移到10mL离心管里,以10000转/分钟离心10分钟。(5)分离:将上清液倒入至干净的小试管里,备用。(对于含水量比较多的样品,在计算定容体积时,还应考虑到样品本身的水份。因此,另取1g左右的包心菜叶片,准确称重g,在微波炉里高温失水,冷却后准确称重g,计算包心菜叶片的含水量,然后再计算出所称样品中含有g(mL)水,加上20mL水的体积,就是本实验样品的准确定容体积。),按下表所示顺序操作。:..~5号管的数据,以蛋白质含量(mg)为横坐标,A595为纵坐标,在坐标纸上绘制标准曲线;;(mg);(单位用mg/g鲜重)。,主要是由什么原因引起的??比较几种测定蛋白质常用方法的优缺点?。-抗坏血酸(Vc)中的—C=C—基具有还原性,还原型L-抗坏血酸能与氧化剂染料2,6-二***酚靛酚作用,染料本身被还原成无色的衍生物,同时还原态的L-抗坏血酸被氧化成无色的脱氢L-抗坏血酸。一定量的样品提取液还原标准染料的量与样品中所含Vc的量成正比。染料2,6-二***酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色,在酸性溶液中呈粉红色。用2,6-二***酚靛酚滴定样品,在达到终点之前,滴下的2,6-二***酚靛酚立即被还原成无色;当溶液中的L-抗坏血酸被消耗完时,滴下的过量的2,6-二***酚靛酚在酸性体系里呈现粉红色。所以当溶液从无色转变成微红色时,即为滴定终点。:25mL×1移液管:10mL×220mL×1容量瓶:100mL×1量筒:50mL×1锥形瓶:100mL×4研钵:1套烧杯:250mL×250mL×1洗瓶:1个纱布:20cm×(2%),6-二***酚靛酚溶液分别称取2,6-二***酚靛酚300mg、碳酸钠300mg,用热蒸馏水200mL溶解并定容至3000mL(过滤除去难溶颗粒,置于棕色瓶中,贮于冰箱中备用。有效期一周,使用前需标定,见附注。)(1)取材:称取新鲜黄瓜10g左右,准确记录称样量g,,与样品一起用纱布包裹住。(2)研磨:样品包置研钵中,加15mL2%草酸,用研棒挤压样包,将样品充分磨细。将汁液转移到100mL容量瓶中。残渣再加15mL2%草酸,继续研磨,汁液再合并到上述容量瓶中。如此反复研磨2~3次,合并汁液。(3)定容:最后用2%草酸定容至V=100mL,摇匀备用。,放入100mL锥形瓶中,立即用2,6-二***酚靛酚溶液滴定至出现粉红色在15秒内不消失为止。记录所用滴定液体积。平行操作三次得V1=mL,V2=mL,V3=mL,取平均值V=mL。%的草酸液20mL,放入另一100mL锥形瓶内,用2,6-二***酚靛酚滴定至终点,记录染料用量V0。(单位用mg/100g鲜重)。,6-二***酚靛酚钠溶液的标定:准确称取Vc20mg,用2%草酸溶解定容至1000mL。:..吸取稀释液20mL,放入100mL锥形瓶中,立即用所要标定的2,6-二***酚靛酚滴定至粉红色出现15秒不消失为止,记录所用毫升数,按下式计算K值(即1mL染料所能氧化抗坏血酸的毫克数)。式中G:称取Vc的毫克数V:滴定20mL标准Vc时所用染料液的毫升数与滴定空白所用毫升数之差值。,并防止与铁铜器具接触,以减少维生素C的氧化。。,测定前于提取液中加2~3mL二***乙烷。在滴定过程中当二***乙烷由无色变为粉红色时,即达终点。?(peroxidase,POD,)是以铁卟啉为辅基的氧化酶,催化HO氧化某些酚类、芳香***和抗坏血酸等还原性物质。它广泛分布于22生物界,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用,如清除细胞内的有害物质HO、保护酶蛋白以及促进植物细胞木质素的形成等。22本实验以愈创木酚(邻甲氧基苯酚)和HO为底物,过氧化物酶催化H2O2放出新生态氧,使无色的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚,反应式22如下:过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系,该产物在460nm有最大的光吸收,故可通过测定A的变化来测定过氧化物酶的活力。460这里规定,一个过氧化物酶活力单位为在室温、,酶反应体系中每分钟A的增加值为1所需的酶量。460活力测定时,酶反应在分光光度计的比色杯内进行,由于酶反应产物增加而使A460增加,通过定时间隔记录可获得一组A值。以时间为横坐标,A460460值为纵坐标进行线性作图(或用统计方法求得回归方程),进而计算A460的变化速率(DA·min-1),最后计算每克鲜重样品中过氧化物酶活力的大小。:..:10mL×1移液管:5mL×1微量进样器:200ml1000ml烧杯:250mL×250mL×1离心管:7mL×1(带盖)滴管:2洗耳球:2硫酸纸研钵、剪刀、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:、-硼砂缓冲液,内含5mmol/L亚硫酸氢钠和1%聚乙烯吡咯烷***(PVP)(临用前加)。、-(%W/V)(溶于50%乙醇中)(临用前配制)(%)(临用前配制)(1)取材:,记下实际质量g。(2)研磨:将样品剪碎于研钵中,加入预冷的酶提取缓冲液5mL,置冰浴上充分研磨。(3)离心:匀浆液全部转入塑料离心管,于4℃下、以10,000g离心15min。上清液全部倒入试管,此上清液即为粗酶液,待测。(1)将分光光度计预热10min,波长定于460nm处。(2)在玻璃比色杯内,先加入2mL醋酸-%愈创木酚溶液,(视酶活力大小而定),%HO溶液,用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀。22(3)立即把比色杯插入比色架,关盖。迅速把A调至0并开始记时,每隔30秒读取并记录A值,共读3分钟。(注:~),A值为纵坐标,对所得数据进行线性作图(或用统计方法求460回归方程);(或回归方程)的斜率,即ΔA·min-1,此为反应的初速460度;,以U·g-1FW表示。:..?,为什么用不同的缓冲液?(Cata1ase,CAT,)是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除H2O2的重要酶之一,其催化的反应为:通过上述反应,CAT可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平,减少自由基和过氧化脂质的形成,对生物体起重要的保护作用。传统测定CAT活力(活性)的方法有滴定法和测压法,但这两种方法不仅误差较大,且比较复杂。本实验采用紫外分光连续记录测定法,具有操作简单,灵敏度高,结果直观的优点。测定时,酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行,分光光度计与记录仪相连接,由于H2O2在240nm处有吸收峰,加入酶液后会使A240下降,而A240下降的情况又可以记录在纸上,从记录的初始直线段计算A240的变化速率DA240·min-1,最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出DA240·min-1·g-1Fw并以此来表示样品中CAT活力的大小。(或其它禾本科植物叶片):1套刻度试管:5mL×10移液管:5mL×1微量进样器:1000ml×1200ml×1(可调)塑料离心管:7mL×1小试管:1支滴管:2洗耳球:2硫酸纸研钵、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:(、,内含l%PVP)(、,):SephadexG-(1)取材:,记下实际质量。(2)研磨:将样品剪碎于研钵中,加入预冷的提取缓冲液5mL,置冰浴上充分研磨。(如不易研磨,加少量石英砂。)(3)离心:匀浆液全部转入7mL塑料离心管,平衡后于4℃下、以10,000g离心10分钟。上清液全部倒入刻度小试管,准确记下其体积,此上清液即为粗酶液,置于冰浴中备用。(1)上样:用可调微量进样器或移液管吸取1mL粗酶液过SphadexG-25小柱(总床体积7mL)(参照“凝胶层析脱盐”实验的上样步骤)。(2)收集:每管收2mL,共收集4支试管,然后关闭出口。(3)检测:,用考马斯亮蓝检测是否有蛋白质。(4)合并:将检测到含有蛋白质的对应的几支管等体积混合,摇匀,即为初步纯化的粗酶液,置于冰浴中备用。(1)紫外分光光度计与记录仪相连接,波长定于240nm处,记录仪的量程定于50mV处,预热10min,仪器调零。(2)在光径为1cm的石英比色皿内,先加入3mLCAT反应液,(视酶活力大小而定),用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒:..混匀数次(不要过分剧烈颠倒);立即把石英比色皿插入比色架上,关盖,同时将记录仪的纸速开关拨至4mm/min处,A240的变化情况被记录于纸上。3min后关闭纸速开关。(3)重复步骤(2),再测定1~2次。,计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值,得ΔA240·min-1,(记录纸的纵轴为时间分钟,横轴为光吸收A240),该余切值代表酶反应的初速度,最后取重复测定的平均值;、酶液总体积和样品鲜重,计算植物样品中CAT活力,以ΔA240·min-1·g-1Fw表示(包括粗酶液与初步纯化的粗酶液)。?它对酶活力测定有何意义??它对酶活力测定有何意义??为什么?如果要计算纯化倍数,还应该做哪些工作,并如何计算?。控制电泳条件,使混合样品中的不同组份带不同电荷,因而各组份在电场中移动方向或速度各不相同,从而达到分离目的。以滤纸作支持物的电泳称为纸电泳。本实验用纸电泳法分离腺一磷(AMP)、腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)。,由于三种腺苷酸带有不同量的磷酸基团,它们解离后,带有负电荷量的顺序为:ATP>ADP>AMP,故能通过电泳在滤纸上得以分离。利用核苷酸的碱基具有紫外吸收性质,将分离后的电泳纸放于紫外灯下,参照标准品,对组份进行鉴定。(水平式):新华1号滤纸条:2cm×25cm移液管:2mL×1洗耳球:2研钵、洗瓶、移液管架、滴管:各1铅笔、尺、毛细管、(,),,溶于蒸馏水,定容至2500mL。:..用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP分别配成100mg/10mL溶液(当日配置,置冰箱备用)。,加2mL水研磨备用。×2cm的滤纸条放在一张清洁的点样衬纸上,在距滤纸条一边7cm处用铅笔轻划一点样线,作记号。用毛细管依次将标准液及混合液点于记号处,注意斑点直径勿超过2mm,每样点2~3次,每点一次用冷风吹干。,纸两端浸入电极缓冲液中。用滴管将电泳缓冲液()均匀地滴于纸上(点样处最后湿润)。盖上电泳槽盖,接上电极,点样端接负极;接通电源,调电压至300V,室温通电2小时;电泳完毕后,关闭电源,取出滤纸,将其用冷风吹干。,将干滤纸置于紫外灯下观察,用铅笔将各斑点划出。并测定各斑点的迁移距离。;,鉴定样品中斑点所代表的核苷酸种类。?激发学生的实验兴趣,在课余时间学****更多的知识,提高学生的实验技能和创新能力,其主要形式有:学生根据个人兴趣和发展方向,查阅资料,自选实验;实验指导教师选定一些实验,学生自由组合选做;由实验教师指定实验项目,学生自行设计。:..参考实验项目(1)钼酸铵比色法测定Vc的含量(2)2,6-二***酚靛酚测定Vc的含量(3)DNA与RNA的提取分离及颜色反应(4)糖的还原作用(5)考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质的含量(6)鸡蛋中(蛋清、蛋黄)蛋白质的测定(7)不连续聚丙烯酰***凝胶垂直板电泳(8)从牛奶中分离制备酪蛋白(9)蛋白***反应和等电点测定(10)双缩脲法测定蛋白质含量(11)蛋白质颜色反应:..(12)RNA的提取与pH的关系(13)盐析测蛋白质含量(14)测定物质中游离的氨基酸浓度(15)苯酚法提取RNA并紫外吸收法测含量(16)血糖的定量测定(17)一定时间唾液淀粉酶体外水解淀粉产物的测定(18)酶促转氨反应(19)***酸含量的测定(20)酪蛋白等电点测定(21)Tales微量快速乳糖测定(22)猪肝脏DNA的提取纯化及鉴定(23)利用酶观察不同条件下失活的蛋白质能否复活(24)Lineweaver-Burk作图法测定唾液淀粉酶Km值(25)蛋白质沉淀反应和***反应(26)唾液淀粉酶比活力的测定(27)碘价的测定(28)皂化价的测定(29)叶绿素含量的测定(30)苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定赠送的部分实验实验一:缓冲液配制和pH值测定本实验教学要求:①了解缓冲液和pH计的基本原理;②掌握配制缓冲液和使用pH计的基本方法。本实验重点、难点:①缓冲液的配制方法;②pH计的使用。实验二:间隔法测定过氧化物酶活力本实验教学要求:①掌握间隔法测定过氧化物酶活力的原理及操作方法;②了解测定酶初速度的意义;③掌握酶活性测定中对照的概念以及具体方法。本实验重点、难点:①测定酶初速度的意义;②酶提取和酶活力测定使用不同缓冲液的原因。实验三:连续记录法测定过氧化氢酶活力:..本实验教学要求:①了解酶活力测定的基本原则与酶活力表示法;②设计简易凝胶层析;③掌握过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算;④进一步理解酶活力、比活力的概念及表示方法。本实验重点、难点:①酶活力、比活力表示法与计算;②凝胶层析柱的安装及装柱技巧。实验四:荧光光度法测定核黄素的含量本实验教学要求:①了解荧光法测定核黄素的原理和方法;②学****荧光光度计的操作和使用,并与可见分光光度计进行相关比较。本实验重点、难点:①设计利用荧光光度法测定核黄素含量的方法;②荧光光度计的使用;③在核黄素含量测定过程中避光的操作和原因。实验五:纸电泳分离鉴定三种腺苷酸本实验教学要求:①了解纸电泳法分离带电颗粒的原理;②观察核苷酸类物质的紫外吸收现象;③了解电泳的一般方法以