第七章免疫学治疗概要.docx

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基因治疗一、基因治疗的概述近代医学与疾病的对抗中,尚有许多疾病直到目前仍束手无策,如癌症、爱滋病、先天性遗传病,以及老化所致机能退化等。按目前的医学发展显示,基因治疗可能是解决上述问题的重要方向。人体内的基因通常是稳定的,但也会在体内的代谢产物、各种射线或化学物质等的作用下发生突变,且突变可以遗传。基因突变实际上就是DNA分子中核苷酸种类数量和顺序的改变,导致遗传信息的改变而致病。由于癌变及遗传怀疾病等是因体内某种基因缺乏、缺陷或突变引起的,因此,对这种基因进行替代、修复和增补,就能治疗这些疾病,从而控制这些疾病的发生,故称基因治疗。1、靶细胞和目的基因目前较常用的基因治疗方法是将有某种功能的外源性基因转移入人体内的受体细胞(靶细胞)内,以补偿患者原来的缺陷基因的功能,即把细胞所需要的基因从外引入,与适当的载体重新组合在一起,转移入靶细胞内进行治病。基因治疗首先要选择靶细胞和目的基因。目前研究和应用得最多的是人体骨髓干细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等,由于骨髓细胞不仅符合以上条件,且许多疾病的发生与之有关,所以是较理想的靶细胞。目的基因则是能弥补、替代缺损基因的外源性正常基因,将目的基因引入靶细胞内,进行基因重组,取代突变基因,新的基因组即可执行正常的功能,从而达到治病的目的。2、基因转移的载体精品文档精品文档3精品文档目前认为腺病毒做载体更具优越性。腺病毒是一种dNA双链无包膜病毒,基因组dNA约36KD,可编码14种蛋白质。该病毒有以下优点:①对人类安全,无致畸、致病及致癌性;②对分裂细胞及颈癌细胞株的转染效率达到90%~100%;③腺病毒感染细胞时dNA不整合到宿主细胞染色体中。因而无潜在激活原癌基因或使抑癌基因失活的危险;④腺病毒容易制备、纯化和浓缩,可达到较高滴度;⑤,容量较大,所以目前国外多用复制缺陷的腺病毒为载体介导p53基因转移。3、基因转移的方式目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节。目前肿瘤基因治疗方式可分为间接体内(回体法)(exvivo)和直接体内(invivo)两种。所谓间接体内(回体法)就是将靶细胞由患者体内取出,于体外完成基因转移后再回输患者体内,此种方法的优点为靶细胞明确、转染效率高;而直接体内是将目的基因插入载体,经修饰后直接注入肿瘤部位或通过血液循环注入体内,在体内完成向靶细胞的基因转移,具有一定盲目性,转染效率低,但较前者简便、费用低,已被越来越多的临床研究所选用。1990年七八月间美国批准了首例临床基因治疗,在几千种遗传病中精选出因腺苷脱氨酶缺陷引起的严重免疫缺陷综合症作为基因治疗首选疾病,因对突变的校正或功能补偿可产生显著疗效且在骨髓移植中已发现DNA正常的单一T细胞可用于治疗且有生长优势。受治患儿为4岁女孩,于1990年9月14日开始接受白细胞透入, 用梯度分离患儿离体血细胞得到单核细胞,培养这些细胞并刺激T淋巴细胞分化,与携带正常ADA基因和NEO基因的载体共培养数日,然后将T细胞输回患儿体内。受治患儿在其后的10个半月中共接受7次自体细胞输注,患儿免疫功能增强,临床症状改善。精品文档精品文档3精品文档ADA基因校正的T细胞相当于正常人的20-25%,其后六个半月未接受基因治疗,然后三至五个月接受一次基因治疗。1991年1月起第二例患儿( 9岁女孩)接受同样基因治疗并取得类似疗效。两例患儿在接受基因治疗笔鄭蜡勋嗩***团钠濤釩闋觞冲为铁。奏效后较少感染,从密闭环境转人正常人生活,并均已入学。自从1990年开始了基因治疗的临床试用以后, 目前整个世界范围已有 2100余病例试用基因治疗各种类型的疾病,如病毒感染( AIDS)、单基因缺陷疾病、肾上腺脑白质营养不良等。但大多数是试用于癌症的治疗。重点为: (1)化学基因治疗,导入对化学疗剂敏感的基因; (2)免疫基因治疗,涉及病人免疫应答能力的调节; (3)肿瘤抑制基因; (4)肿瘤生长和侵袭力的控制,如阻止血管生成。二、癌症的基因治疗1、化学基因疗法化学疗法是向肿瘤细胞导入***基因,这些基因能编码一些使对肿瘤细胞原本无害的物质(原药)转变成为对肿瘤细胞有害的酶类, 这种疗法的使用可以避免通常所用化疗时所见的一些全身性副作用。目前最常用的是单纯疱疹病毒胸苷激酶( herpessimplexthymidinekinase,HSV-tk)基因。Tk基因表达产物为一种酶,此酶可使9-(1,3-二羟-2-丙氧***)鸟苷(ganciclovir,GCV)磷酸化。单磷酸化的GCV在细胞内转换成三磷酸形式,掺入分裂细胞的DNA中,抑制DNA的合成,从而破坏肿瘤细胞,故又称为病毒介导的酶促前药物激活法(virus-directedenzymeprodrugtherapy,VDEPT)。TNF 能下调多种耐药性基因( mdr)的表达,从而使肿瘤细胞发生化学致敏作用(chemosensitization)。这一作用作为癌症的基因治疗和化学治疗联合疗法的基础。2、免疫基因治疗由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态, 而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强(如 MHC 表达不足),也可源于抗原递呈细胞(APC)不能提供足够的共刺激信号(如 B7),或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下三种方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态。(1)、将某些细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等)的基因转染到机体免疫细胞(如 TIL、LAK 细胞及细胞毒淋巴细胞)中,以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力,这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。这些细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点,疗效也有提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全,已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法。2)由于肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和(或)共刺激信号表达不足,可以将一些与免疫识别有关的基因(如HLA、B7等)转染到体外培养的肿瘤细胞,经照射后再植入肿瘤患者体内;或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内,以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性,诱导宿主的免疫反应。3)制备肿瘤DNA瘤苗,即将编码特异抗原的基因直接注入人体,通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。 如应用癌胚抗原(CEA)制备的肿瘤 DNA瘤苗在实验中显示出一定的效果。对细胞裂解性T细胞的直接活化或通过其活化调节物的间接活化是很多基因治疗的研究重心。3、***基因疗法将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞,使肿瘤细胞产生某些酶类,精品文档精品文档4精品文档将原来无毒的抗病毒药物或化疗前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞, 这种使肿瘤细胞***的基因称为***基因。 目前肿瘤基因治疗中广泛应用并举有较好临床前景的***基因主要有:单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV-tk)和细菌胞嘧啶脱氨酶基因 (CD)。如Nagy等利用HSV1-tk重组逆转录病毒质粒实验发现 HSV1-tk基因转导的结肠癌细胞和肝癌细胞对GCV(丙氧鸟苷)毒性反应的敏感性较其亲本细胞高 1000倍。粮寻掼奋嗎谤純徕欄报惡贷絨閏煒。精品文档精品文档5精品文档***基因疗法可以实现选择性原位转导和特异性杀伤,避免了应用exvivo技术基因疗法中步骤繁多、技术要求高、难度大的靶细胞获取及培养、目的基因转导、筛选及回输等过程,从而使其成为较早进入临床的基因治疗方法之一。4、肿瘤抑制基因(1)抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入治疗:癌细胞不同于正常细胞的生长表型缘于其基因水平上抑癌基因突变、失活和(或)癌基因的突变、扩增、过度表达。针对前者可以将具有正常功能的野生型抑癌基因通过各种途径转染至肿瘤细胞中,重建失活的抑癌基因功能,恢复细胞的正常生长表型,或者诱导肿瘤细胞凋亡,从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。对于后者,可通过转化质粒到肿瘤细胞中表达出反义RNA、或直接给予反义寡核苷酸、或予特异的核酶处理,从而达到抑制异常活化癌基因的目的。目前抑癌基因治疗在肿瘤基因治疗中较为活跃,其中研究较多的是p53基因。1990年Baker等首先观察到p53导入肿瘤细胞后,肿瘤细胞出现了明显的凋亡。Roth于1993年应用载有野生型p53的重组逆转录或腺病毒载体进行人体肺癌的实验治疗,出现了8%的部分缓解率,64%病情稳定的效果。针对癌细胞癌基因异常活化而设计的反义核酸技术可有效调节肿瘤细胞中基因表达。具体应用方法有二:一是利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞,在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA,从而阻断目的基因蛋白质的表达;二是体外人工合精品文档精品文档7精品文档成反义寡核苷酸。由于第二种方法相对简单,故多数反义核酸基因治疗研究均采用了这种技术。反义核酸基因治疗在靶基因选择上,可以分为癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体细胞信号传导系统、细胞周期调控物质、酶类及其它。反义核酸基因治疗不但在体外实验和动物模型上取得了显著效果,临床试验亦显示出良好效果。5、抗肿瘤血管形成基因治疗考虑到血管形成在肿瘤发生中的重要作用,抗血管形成的治疗成为非常有潜力的控制肿瘤生长的治疗方法。虽然在研究中发现近年发展的血管生成抑制剂Angiostatin和Endostatin对肿瘤动物模型有明确疗效,但是长期而系统地给予蛋白质药物代价昂贵,且需经常给药,抗血管生成基因治疗在较大程度上解决了这一问题。近年来抗血管生成基因治疗的研究主要包括:(1)针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗;(2)血管形成抑制因子基因治疗;3)针对肿瘤血管内皮细胞的***基因治疗等。这些方法通过特异作用于瘤床的微血管内皮细胞而控制肿瘤生长,虽然目前抗血管形成基因治疗尚未进入临床,但可以相信其会有较广泛的临床应用前景。二、自身免疫病的基因治疗自身免疫病的基因治疗研究有长足的进展,涉及多种自身免疫疾病的治疗。其治疗原则是对自身反应性记忆 T细胞和自身免疫靶细胞进行基因修饰,使之产生免疫调节性细胞因子和再生性生长因子, 用于治疗自身免疫病。 具有导致自身免疫病发生的细胞可因基因修饰后而产生可免受自身免疫作用破坏的免疫调节性细胞因子。此类靶细胞包括 IDDM 的胰岛细胞、多发性硬化症中产生髓磷脂的少突胶质细胞和类风湿性关节炎中的滑膜细胞。这种治疗方式称为靶组织基因治疗 (herapy)。另外,自身反应性 T细胞亦可蒙受基因改变而释放针对自身免疫病变的抗炎症细胞因子, 作用于自身免疫性炎症反应。 这种治疗方式则称为 T细胞介导基因治疗( Tcell-herapy)。此外,自身免疫靶细胞和自身反应性 T细胞尚可因基因修饰而产生治疗性的转基因生长因子,介导自身免疫病时组织的修复,这种治疗方式称为再生性基因治疗( herapy)。1、靶组织基因治疗涨蝦賽铕偾鈥贪饼亏蝕醫榄价嚙殞。精品文档精品文档7精品文档许多自身免疫病由Th1细胞介导发生,这种T细胞亚群表达促炎症细胞因子IFN-、IL-2和TNF;而自身免疫性的调节则由表达抗炎细胞因子IL-4和IL-10所介导。基因治疗能使作用于自身免疫性破坏的细胞产生抑制Th1细胞介导炎症发生的治疗性因子。这种靶组织基因治疗可以避免在全身使用免疫抑制剂或免疫调节性细胞因子广泛表达时所发生的一系列不良反应。2、T细胞介导基因治疗EAE是多发性硬化症的动物模型,由CD4+Th1细胞介导发生。这种细胞可识别中枢神经系统髓磷脂蛋白上的肽决定簇,并引起伴有中枢神经系统白质中脱髓鞘的一系列病变。在EAE发生时若注入CD4+Th2细胞,则疾病的发生受到抑制。Mathisen等使EAE小鼠的自身反应性T细胞发生基因修饰,使之在以PLP活化后表达IL-10转基因。构建物的IL-2启动子区可调节IL-10cDNA的表达。因此,IL-10转基因在转染的T细胞与PLP自身抗原结合后即成为可诱导者。经转染的T细胞能抑制EAE的发生,且治疗效应是抗原特异性的。可见基因修饰的自身反应性T细胞可用作一种有效的制剂,以一种抗原诱导性方式释放治疗性T细胞基因产物至自身免疫炎症环境之中。3、全身性体内基因传导体内基因传导法为直接将带有治疗基因的载体注射体内。全身基因治疗可用静脉或肌肉注射,或者植入包被有经过基因修饰的异质性细胞,用以保护性的细胞因子,如 (关节炎和类风湿关节炎) IL-4或IL-13。这种方法的特点是在所有的关节及对类风湿关节炎关节外特征具有感受性的器官内, 都可获得一定浓度的治疗性蛋白质, 其主要缺点在于其产生与细胞因子或细胞因子抑制物全身表达有关的不良反应。然而,获得临床效果所需细胞因子 /肽类的浓度远较所用重组细胞因子每日注射的用量为低。4、局部基因转导载体的关节内注射便于接近至类风湿关节炎中的破坏过程,故能使达鼠滑膜细胞在应用含有TNF-R基因的腺病毒载体的实验中发生有效的转导。另一种抑制滑膜细胞产生促炎症细胞因子的方法为将反义核苷酸转导至关节。 Forre应用阳离子脂质体介导的转染法将 TNF- 特异性核酸转导酶转至外周单个核细胞。核酶的转精品文档精品文档8精品文档导使TNF- mRNA表达降低 90%,使蛋白质表达下降 85%。目前计划将对 TNF- 特异的核酶转导至类风湿关节炎病人的关节。其他基于抑制促炎症细胞因子的治疗有抗 TNF- 单克隆抗体、可溶性的 p75TNF-R、TNF-R、TNF-RII、IL-1ra等。晉臥鄧躉鸵狯嵐谘銮饴纯鰲阵潁槛。第二节 抗体的免疫学治疗一、单克隆抗体二、双向特异性抗体的免疫治疗作用双向特异性抗体( bispecificantibodiesmBsAb)可使针对靶向肿瘤或病原体的免疫效应活性改变方向或者增强这种免疫效应。 原型的BsAb包括两种共价键连接的抗体或抗体片段,其中一种抗体针对其作用对象的靶分子, 另一抗体则针对激活分子。 20世纪80年代的BsAb多以化学交联或由两种杂交瘤细胞株的融合而产生。 90年代中,遗传工程技术为 BsAb的制备提供了多种形式的方法,包括基于单链 Fv分子的 BsAb(dia-bodies)及血清半寿期增加改良多价BsAb。目前主要集中于以肿瘤和微生物病原体作为 BsAb的作用对象(表 1),但是在基因治疗和血栓形成的作用上也有其应用。鏡員败笕顺闞钨钧鹎闹瘾恒罗梟铂。精品文档精品文档9精品文档1、BsAb治疗的效应分子采用TCR/CD3分子作为激活分子, 及协同刺激作用在T细胞效应能力上的重要性。可精品文档精品文档13精品文档表7-1BsAb的研究靶细胞红细胞T细胞NK细胞中性粒细胞单核细胞/巨噬细胞树突细胞激活分子CR1TCR/CD3CD16CD64CD64CD64CD2CD44(活化PMN)CD89CD69CD89CD38CR3CD56(CD11b/CD18)功能作用清除病原体杀伤肿瘤杀伤肿瘤杀伤肿瘤细胞杀伤或吞噬肿瘤细胞增强抗原自身抗体和细胞细胞吞噬作用/及病原体,增强抗原呈递过程免疫复合物杀伤病原体呈递过程溶性CD40L能增强作用 B细胞上协同刺激分子的表达, 使以T细胞为基础的免疫疗法更为有效。用IgG受体FcRIII(CD16)作为活化 NK细胞细胞毒作用的激活分子。 此外还有一些具有相同功能的激活分子,如CD44、CD69、CD38和CD56。针对这些激活分子的抗体均可引起颗粒外脱(exocytosis),而最易引起外脱者为抗CD16和CD38的抗体。应用IgAFcR(CD89)作为BsAb疗法的激活分子。这种受体在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达,能极为有效地激活靶细胞裂解。2、BsAb治疗的靶分子实验性B细胞淋巴瘤中的研究结果表明,BsAb的靶分子特异性对于治疗效果有明显的影响。如B细胞独特型和CD40,对带瘤小鼠的生存表现明显的影响。内皮细胞也可作为BsAb的一种新的治疗靶细胞。BsAb能作为作用于肿瘤组织血管的载体以诱导血栓的形成(38%的巨大成神经细胞瘤消退)。3、BsAb的临床应用三、天然抗Gal抗体增强自体肿瘤免疫原性的作用讨灃鸚灤军熾則顷爾摈顏詿歼鯔跹。已有许多事实说明在很多人类肿瘤中存在肿瘤相关抗原(TAA),此外许多肿瘤生长物存在的宿主单个核细胞与TAA作用后能导致肿瘤的排斥。目前已知限制TAA诱发抗肿瘤免精品文档精品文档12精品文档