邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯诱导人卵巢颗粒细胞系KGN细胞铁死亡的作用研究.pdf

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测试剂盒(北24h。镜下观察结果显示,对照组KGN细胞形态京索莱宝)说明书加入相应试剂,充分混匀,25℃静正常,呈成纤维样或梭形并向周围伸出伪足;100、万方数据:..生殖医学杂志2023年10月第32卷第10期200tLmol/I。MEHP处理后细胞形态无明显改变,少,逐渐皱缩变圆,失去梭形和伪足样结构,且随着400、800、1600ymol/I。MEHP处理后细胞数量减浓度的增加,形态改变愈加明显(图1)。K一8检测了不同浓度MEHP对KGN的为了研究MEHP对KGN细胞的影响,用0(对细胞活力和增殖能力的影响,结果显示,与对照组相照组)、100、200、400弘mol/I。浓度的MEHP处理细比较,100、200ymol/I。MEHP处理组细胞活力无显胞并检测铁死亡相关蛋白的表达变化。WB结果显著改变(P>),400肛mol/I。MEHP处理组细胞活示,100、200、400ffmol/I。各组中的ACSI。%,800、1600ymol/I,MEHP达随着MEHP浓度增加而增加,与对照组比较,处理组减少至对照组的40%以下(P<)(图2)。400tzmol/I。MEHP处理组ACSL4蛋白表达显著即随着MEHP浓度的增加,KGN细胞的存活率逐渐增加(P<);与对照组比较,200、400雎mol/I。下降,高浓度的MEHP可以抑制KGN细胞的增殖。MEHP处理组GPX4蛋白表达显著下降(P%);与对照组比较,400肚mol/I。MEHP处理组SI。C7A11和FTHl蛋白表达均显著下降(P%)(图3)。三、MEHP对KGN细胞铁含量的影响与对照组比较,400ffmol/I。MEHP处理组的弋细胞铁含量增加,差异具有统计学意义(P<)(图4)。氧叶三、MEHP对KGN细胞氧化应激的影响MDA检测试剂盒分析结果显示,与对照组比∥◇椤p≯\p较,400ffmol/I。MEHP处理组细胞内MDA含量显MEHP,(/umol/L)著增加(P<)(图5)。我们用DCFH—DA和与对照组比较,。P<,一P<。DHE荧光探针检测了细胞内的ROS和超氧化物阴离子的水平,结果显示,MEHP处理后细胞内ROS二、MEHP对KGN细胞铁死亡相关蛋白表达和超氧化物阴离子水平升高(图6)。这表明MEHP水平的影响使得KGN细胞氧化应激水平增加。万方数据:..【I=o宁迫\寸一∽U<§§§MEHP/(Itmol/L)×山×;口u守粤一一《卜uJ∽$§◇§§§妒MEHP/(/(“moULMEHP/(umol/L)、:WB法检测铁死亡相关蛋白的表达;B:ACSI,4蛋F{相对表达量;(1:GPX4蛋白相对表达量;DSI。(、7A11蛋白相对表达量;E:FTHl蛋白相对表达量。与对照组比较.。P图3WB检测不同浓度MEHP处理K(;N细胞铁死亡相关蛋|,{的表达2O捌如莨0翌《~∥‰与∥眦较/~夕一图4MliH【)处理后K(;N细胞铁含量变化图5MEHP处删后K(;N细胞MI)A含量的变化万方数据:..生殖医学杂志2023年10月第32卷第10期33342:蓝色荧光代表细胞核;DCFH—DA:绿色荧光代表R()S;DHE:红色荧光代表超氧化物阴声图6MEHP处理后KGN细胞ROS和超氧化物阴离子水平的变化(免疫荧光染色×200)致细胞内谷氨酸堆积,GSH合成减少,进而导致讨论GPX4活性下降[20I。GPX4是细胞内最重要的抗氧DEHP是目前应用最广泛的增塑剂,作为一种化物,它可以清除细胞内的脂质过氧化物,是调控铁环境内分泌干扰物,其具有类雌激素作用,对人类和死亡的关键蛋白[21|。MEHP通过ACSI。4表达上动物的生殖功能有损伤作用[15|。由于女性特殊的调使脂质过氧化物产生增加,同时GPX4的蛋白表生理特点和生活****惯,DEHP暴露的机会明显高于达和活性降低,无法及时清除脂质过氧化物,进而引男性。但是由于女性生殖系统相对复杂,因此DEHP起KGN细胞铁死亡抑制细胞增殖能力。和MEHP的雌性生殖毒性的研究少见报道。女性脂质过氧化和铁离子的蓄积是铁死亡的标志性生殖发育和功能的异常,如子宫内膜异位症、各种妊特征[1…。外周循环中的Fe”通过转铁蛋白和转铁娠并发症、流产和早产等,都证实与DEHP的暴露蛋白受体的结合进入细胞,还原为Fe。+,多余的铁有关[1…。卵巢颗粒细胞的增殖和分化能调节卵泡则储存在铁蛋白FTHl和FTL中。过量铁主要通的生长和成熟,其状态是决定卵泡最终命运的关过芬顿反应产生的活性氧而引发铁死亡[22。,铁离子键[17I,且已有研究表明卵巢颗粒细胞可能是DEHP的水平与丙二醛、ROS等过氧化产物的产生量呈正代谢产物MEHP的靶细胞u…。因此,我们在体外相关。本研究结果显示,MEHP增加了KGN细胞通过人KGN细胞建立MEHP损伤颗粒细胞模型的铁含量,MDA、ROS、超氧化物阴离子等也明显增来探究DEHP对卵巢的损伤机制。加。铁自噬是细胞内铁离子释放的主要过程,对铁本研究发现,KGN细胞的活力和增殖能力随稳态的调节至关重要,其是由FTHl介导的[2…。着MEHP剂量的增大而降低,细胞形态也发生明显MEHP可能通过激活铁自噬使得储存在FTHl的变化,失去伪足样结构。我们还发现400肛mol/I。铁离子被释放成为游离铁,细胞内铁增加,进而通过的MEHP使得KGN细胞的ACSI。4蛋白表达增芬顿反应产生大量活性氧引发铁死亡。加,GPX4、SI。C7A11、FTHl蛋白表达水平均显著综上所述,本研究通过铁代谢、氧化应激和铁死下降。ACSI。4是脂质过氧化物产生的关键酶,也是亡调控因子蛋白表达的异常初步显示了铁死亡是铁死亡的生物标志物和敏感调控因子[1…。SI。C7A11MEHP诱导人卵巢颗粒细胞KGN细胞发生死亡的是SystemXC的重要组成部分,其表达减少时,重要途径,为DEHP和MEHP的雌性生殖毒性机SystemXC一被阻断,谷氨酸与胱氨酸不能互换,导制研究开拓了新思路。但是本研究仅局限于KGN万方数据:..垒殖医学杂志2023年10月第32卷第10期细胞,缺乏卵巢方面的研究,且仅涉及铁死亡的部分[11]吴维光,史海霞,韩建秋,,具有局限性,其发生铁死亡的具体机制还有待对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡Caspase通路的影响[J].环境卫生学杂志,2012,2:149—。[121TangD,KangR,BergheTV,[,2019,29:347—364.【参考文献】[13]DixonsJ,LembergKM,LamprechtMR,:[11Cuadros—RodriguezL,Lazoen—MurosM,Ruiz—SambldsC,aniron-elldeath[J].Cell,,149:1060—[141ZhaoY,ZhangH,CuiJG,[,2020,583:—testisbarrierdysfunctionvia[23RuJ,[J].RedoxBiol,2023,Y,Yangdegradationofplasticwastes[J].FrontMicrobiol,2020,11:442。59:102584.[3][151LiuJC,XingCH。XuY,[J].IntJAndrol,2006,29:134—[43LiN,LiuK,YuanH,-(2一developmentofoffspring[J].JHazardMater,2021,ethylhexyl)phthalateonapoptosisofratovariangranulosa416:[J].EnvironToxicolPharmacol,2015,39:[16]-[5]HuangH,ZhangXY,ChenTL,[J].EnvironRes,2008,108:177—[17]FanH,HeJ,BaiY,(2-ethylhexyl)phthalate[,2019,67:8548—[J].JOvarianRes,2022,15:[61HaniokaN,IsobeT,OhkawaraS,(2一[18]Lovekamp-SwanT,)phthalateinhumans,monkeys,dogs,rats,andtoxicityinthefemalereproductivesystem[J].Environmice:aninvitroanalysisusingIiverandintestinalmicrosomesHealthPerspect,2003,111:139一145.[J].ToxicolInVitro,2019。54:237—242.[191DollS,hB,TyurinaYY,[7],PoissenotK,[J].NatChemBiol,2017,13:91—(2-ethylhexyl)phthalatein"mice[J].Environ[203SunY,ChenP,ZhaiB,,2017,125:[J].BiomedPharmacother,2020,[8]RogersR,OuelletG,BrownC,—talkbetweenthe127:-kappaBsignalingpathwaysinhibitsMEHP-[21]FriedmannAngeliJP,[J].ToxicolSci,2008,106:symbiosis[,2018,127:153——508.[22]D’HerdeK,:oxidizedPEstrigger[9]AldyrevaMV,KlimovaTS,IziumovaAS,[J].NatChemBiol,2017,13:4-[23]ManciasJD,PontanoVaitesL,NissimS,[J].GigProfZabol,1975,12:25—[10]HannonPR,BrannickW,etisregulatedbyirondependentHERC2一mediatedproteolysisKE,(2-ethylhexyl)eleratesearlyfolliculogenesisandinhibits[J/OL].Elife,2015,4:[J].BiolReprod,2015,92:120.[编辑:郭永]万方