蜜环菌属真菌CPCC+400891中倍半萜合成酶多样性与功能研究.pdf

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。万方数据蜜环菌属真菌中倍半萜合成酶多样性与功能研究李岩,冯健举君铞析,王浩嗬,李涛健”,,北京;本┕ど檀笱称酚虢】笛г海本琇猄籄黼一/=岷掀嗌滓质谱联用仪检索比对,共鉴定个倍半萜分子,包括谎┧上一雪松烯、罗汉柏烯、杜松萜烯、换ò叵┖捅铣惹汛嫉取狹觳关键词:蜜环菌属;基因组挖掘;倍半萜合成酶;异源表达;分子系统进化树;功能鉴定琖生物资源,摘要:本论文以蜜环菌属婢鶦为研究对象,基因组挖掘分析发现该菌株基因组中含有个倍半萜合成酶编码基因,但其功能却鲜有报道。采用色氨酸营养缺陷型表达载体,并以酿酒酵母,—治銎教ǎ怨菇ǖ闹刈榫—猄籅狝—发酵产物进行采集分析。结果显示,蜜环菌来源的个倍半萜合成酶归属于新的类群:亚家族Ⅳ。同时,个倍半萜合成酶在酿酒酵母中确定表达。根据美国国家标准与技术研究院的标准参考数据库://畁甮/分析发现,亚家族Ⅳ类群倍半萜合成酶均能合成多个倍半萜分子。综上所述,本研究为后续改造并优化特定倍半萜合成酶,从而为深入开展的催化机制研究奠定基础,也为从蘑菇类大型真菌中发现更多新颖的倍半萜合成酶提供依据和思考。中图分类号:文献标志码:文章编号:———,琙瓸,,—猄籅狝——,,.,·琤.,—瓻收稿日期:——修回日期:——接受日期:——作者简介:李岩,女,博士生,主要从事植物源食品开发与利用。猰簂甤ㄑ读O等耍豪罱一校┦浚淌冢芯糠较蛭J称贩缥兜男纬捎胧头牛参锛笆称房7ⅲ珽簂..甤;张涛,男,博士,副研究员,研究方向为微生物天然产物生物合成与合成生物学,:国家自然科学基金;中国医学科学院医学与健康科技创新工程一卜一卜;北京协和医学院基本科研业务费珻,.—万方数据系统,从虎乳灵芝锄猄嵋籗忻苈胱佑呕⒁煸一琧—,籧一,?。蜜环菌又名榛蘑、青冈蕈,是一种药食兼用的高等真菌,广泛分布于世界热带和温带的森林地区。捅栋胼拼挤枷闼狨ダ啵约岸啤㈢薮肌⒍糖、黄***、有机酸、腺苷类等多种类型次级代谢产物心R├硌芯勘砻鳎刍肪⒔臀镏饕>哂姓蚓病催眠、抗惊厥、改善晕眩综合症、保护心脑血管和增强免疫等作用心甏尤斯し⒔偷拿刍肪丝体中分离得到第一个原伊鲁烷型倍半萜醇芳香酸酯类化合物蜜环菌酯有学者从蜜环菌菌丝体中分离得到个同系物,包激活策略从菌蛔峨倍半萜合成酶可催化线性的前体法尼包括毛韧革菌蟹掷氲膕类兔刍肪蟹掷氲膍类化合物等。基因组数据显示,蘑菇类大型真菌含有丰富的倍半萜合成酶编码基因,平均~个针对这些倍半萜合成酶的功能表征也成为近些年天然产物生物合成研究的热点问题,大肠杆菌—斜泶锒虶都可以产生多个倍半萜分子心。从柱状田头菇鉴定出个倍半萜合成酶编码基因,利用大肠杆菌成功表达觯渲校珹涸鹪谅惩楸栋胼葡┑生物合成,负责/纳合成,而,,和可产生多个不同示,该菌株基因组除编码嘣虞品肿拥基因,表明该菌株倍半萜类化合物的代谢谱可能很材料、试剂和仪器李岩等:蜜环菌属真菌中倍半萜合成酶多样性与功能研究狹://畁甮/瑂籧蜜环菌含有特征性化学成分原伊鲁烷—。此后,括蜜环菌甲素刍肪焖和蜜环菌庚素等晴’“。年,,其中鑫P禄衔铮状未用刍肪艟株中分离出类化合物。同时,嘣虞品肿泳哂邢灾纳镅Щ钚裕热缑刍菌丁素等能较好地抑制金黄色葡萄球钚跃伞啊刍肪能抑制人白血病、、一细胞生长并诱导细胞凋亡,对人结肠癌细胞、人急性淋巴白血病细胞、人白血病赴腿巳橄侔细胞具有细胞毒性基焦磷酸铣珊鎏荚拥木哂辛醋春环状等结构的萜类化合物·1栋胼坪铣擅敢级联的碳正离子反应、环化和重排反应,从而合成多种骨架新颖的倍半萜分子。同时,这些倍半萜分子又成为微生物天然产物活性分子的重要结构单元,湍鹁平湍是常用的表达宿主钆@媚鹁平湍窧拗松烷型倍半萜籺涂谝籧,其中蜃橹的倍半萜分子‘”依据;〉纳镄畔⒀诰蛳生物合成基因簇外,还携带个倍半萜合成酶编码丰富并具有化学多样性。为进一步探究这些可能生物合成元件的功能和代谢潜力,本文利用酿酒酵母一为宿主菌,对个编码基因表达。结合气相色谱一质谱联用分析和标准参考数据库://畁甮/焖鞅榷裕对菌株中倍半萜合成酶的功能、合成倍半萜化合物分子的结构作了初步鉴定和表征。·.,.,—瑃瓸谝籬.,—.—.篈籫;;;;—.。万方数据酸营养缺陷型培养基猅直鸸鹤运骼潮拦鶤公司琒腿⊥/国微生物菌种保藏管理中心,现保存于中国药学微生物菌种保藏管理中心。大肠杆菌—用作基因克隆宿主菌,酿酒酵母一用于制备酵母重组和蛋白表达宿主菌。—为酵母表达质粒。马铃薯葡萄糖琼脂培养基郝砹迨砥咸糖肉汤碇袅笏琍培养基购自美国公司R禾迮嘌:,色氨司,和北京酷来搏技术有限公司。.约劣胍瞧涣涟彼幔蜞奏ず桶避忻顾氐裙鹤訟等公司。高保真酆厦浮⑾拗菩阅谇酶裙鹤訬公司。高压灭菌锅毡維—公司咚倮涠忱胄幕美国公司型气相色谱一质谱联用仪狹,—兔腹苤狿拦鶶公司=夯厥帐约梁和质粒提取试剂盒购自公司,—酵母转化试剂盒购自公司,酵母质粒提取试剂盒购自索莱宝公司。菌株与构建基因工程菌见表生物信息学分析与分子系统进化树构建微生物次级代谢产物合成基因簇预测通过—蚐海痺./谙呤菘夥治觥5鞍坠δ茏⑹陀肂程序海痺..。氨基酸序列使用狽算法进行多序列比对心,对排后的数据集使用鹘徊接呕硇J菁褂媚P退蜒叭砑邢低撤⒂罴涯P脱≡基于方法生物资源·,.,.表狙芯渴褂玫木万方数据因连锁成簇,比如猄珹—,猄,猄等。其中,猄曜。,运行代数设置为,,当聚合诊断值少于笔游4锏骄酆系停止运算。所有采样树的前%视为猧。〈采吓嘌9顺鼍刻澹再用无菌水洗涤次,用灭菌的滤纸包住放置晾干。,加入基因组提取缓冲液,%心,。充分混匀,静置痬离心上清,加入等体积的异丙醇混匀,胄ヒ掖枷吹右淮巍锨澹栏珊蠹尤癓去离子水,加/保温%的琼脂糖电泳检测。.蚝铣伞扩增,克隆与测序倍半萜合成酶编码基因密码子优化与基弘×缓冲液,期间涡悬次。将上述菌液涂布色氨酸营养缺陷型一嘌桨迳希培养过夜。酵母质粒提取操作步骤详见说明书。.攴⒔将对照菌株—椭刈榫鶥狝—一接种于—Q毕菪团嘌基,℃培养箱培养至=刈榫投哉站分别接种于的—Q毕菪鸵禾迮嘌基。,准确称量罚糜顶空瓶中,℃平衡褂肧腿⊥吩℃萃取。—分析由北京工商大学食品风味化学重点实验室型—联用仪平台完成。件下解析I鲁绦蛭F鹗嘉露妫3后,以妫痬的速率升温至℃,以妫痬的速率升温至妫僖℃/乃俾噬轮妗:笤诵形露任℃,时间为质谱条件:采用离子源和的电子能量,传输线温度妫胱釉次露℃,四极杆温度妫芗裂映枘J剑柿可璺段倍半萜合成酶编码基因挖掘及生物信息学李岩等:蜜环菌属真菌中倍半萜合成酶多样性与功能研究。海痶産...//<尤隩ズ头佑肼确赂“痬离心人癓因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。扩增体系为:弑U婢酆厦诺维赞甃,引物各荓,质粒模板隠,。デ脂糖凝胶电泳检测,切目的条带,用胶回收试剂盒回收蚱巍>銹筛选阳性克隆子送至生物工程虾股份有限公司测序。.湍父惺芴票浮⒆;椭柿L崛将酵母细胞划线接种于桨迳デ碇粉N孪培养。挑单菌落接种于禾培养基中,。痬摇床过夜培养。将上述茵液接种到的嘌校髡鹢!!!V痬振荡培养!,加入的匦湍赶赴馗蠢胄牟街瑁尤的重悬细胞,并分装至离心管中,一。4妗=玃回收产物肚⑾咝化载体稬加入酿酒酵母感受态细胞中,加,涡悬混匀,。跤玫街肿右痳。取气相条件:萃取纤维插人进样口,嫣峁敕治分析菘饪捎米魑⑸锾烊徊锷物合成基因簇查询和预测心。对蜜环菌的基因组分析发现,目标菌株共含有个生物合成基因簇,包括聚***类觯呛颂翘宥嚯睦个,萜类个,杂萜类龊推渌个。进一步结合本地治觯不竦霰栋胼粕锖铣基因。如图荆庑┗簇嘈桶种情况:①倍半萜合成酶编码基因单独存在,如猄等;②倍半萜合成酶编码基因与其他基与氧化酶、短链脱氢酶和聚***合成酶等编码基因连锁,共同负责杂萜嗷衔锏纳合成·—。,。~,。痳入疘腟—猄—行一珹湟籗珹猄珹—,■一一’?卜一一弧王￥半一◆,我们构建了的分子系统进化树。“、柱状田头菇、茶树菇、褐腐菌⒒乳灵芝、毛韧革菌、蚁巢伞属菌.⑺筛斓f軱菌、砖半萜分子的生物合成,该类亚家族倍半萜合成酶烯和口一等川。③包括猄猄霰栋胼坪铣擅腹槭粲谘羌易,该亚家族倍半萜合成酶目前报道比较少【倍半萜合成酶功能鉴定和产物分析将株蜜环菌来源的倍半萜合成酶重组菌直鸾又钟赟猅营养缺陷型培养基和⒔团嘌嘌螅肪璆狹治觥M过样品的质谱图和相关信息,就可以得到样品的定性定量结果。结果表明,有株重组菌能够检测到珹猄为明确蜜环菌基因组编菘庵邢略赝幢栋胼坪铣擅感蛄小⒂ü饫嗥旯痕粉孢革菌、灰盖拟鬼伞,.砌红韧黑伞、。分子系统进化树如图荆蜜环菌的倍半萜合成酶大致分为个亚类:①猄负责合成一原伊鲁烷倍半萜烯,与蜜环菌来源的聚为一支,编码基因猄为嗷衔锷锖铣苫因簇的重要结构基因。②猄珹—,猄珹—赡芨涸鸷铣梢兰油烯—/杜松萜烯—啾可能负责多种倍半萜分子的生物合成,如茶树菇来源的和可能生成衣兰油烯,杜松萜因此,对该亚家族倍半萜合成酶功能的研究也更有意义。,骸、/珻。。!或痾,。,包括—猄珺M保硗株重组菌和对照菌均未能检测到相关分子量,说明蜜环菌来源的个倍半萜合成酶可在酿酒酵母宿主菌中表达成功,株重组菌共检测到种倍半萜分子,包括雪松烯—一乍物资源图刍肪甿基因组中编码基因注:—;琺—猄珺狝—虰狝—·忉珹—和甋痳一—猄珺狝—,—猄珺猄,—猄,—猄珺蜹甿甋,猄甋:狝—珹籗猄;瑂——;,.Ⅲ琁、’,’¨·,川~】卜海蘪,’√』,’√州緅⒍、一¨¨¨【⒁籌一.。万方数据百鰆面两夏蕊百杵沙啊一齦‘狮晒一蝎两永沌弼痩縁盏黜船嬲’测螂舸Ⅱ一。—母麟碊,铘一一一籢也膌㈣烯,同时,也能合成少量的甘香烯和,猄,猄虯—在酿酒酵母宿主系统中也表李岩等:蜜环菌属真菌中倍半萜合成酶多样性与功能研究黶丽一。啼婧涂谝籬⒙藓喊叵猼、原伊鲁烷倍半萜烯籶一榄香烯、杜松萜烯籧、卢一花柏烯我⒐虐拖口一和甘香烯等。同时,—也检测到韦得醇⒈铣茄醇谝籧退骋籞一口一环氧化红没药烯—豢谝和花侧柏烯籧图。利用酿酒酵母对虎乳灵芝中倍半萜合成酶煸幢泶镆布觳獾介枷┐己捅铣惹汛嫉存在,说明宿主细胞酿酒酵母中内源的细胞色素等氧化酶可能会对前体倍半萜分子,。骸进一步催化。从而生成韦得醇、毕橙茄醇和花侧柏烯等化合物。—猄产生口一雪松烯,猄⒔筒生谎┧上猄⒔椭鞑镂猵一雪松口一花柏烯。重组菌—铣稍谅烷倍半萜烯外,仍能合成少量罗汉柏烯和口一古巴烯。有意思的是,属于倍半萜合成酶亚家族的达,该亚家族的的代谢产物更加复杂,一般种倍半萜化合物。比如重组菌—⒔椭鞑镂B藓喊叵.%共较大量的口雪松烯和少量的菖蒲二烯·小一一一—罥Ⅲ厉图诒栋胼坪铣擅蛄蟹治龉菇ǚ肿酉低辰注:“,以三萜合成酶狣置根;相近的担子纲真菌中倍半萜合成酶的序列从竦茫肕进行多序列比对.㈣;—,猄—税谅潮栋胼葡分支群——·.籊R籊■杜松烯类种篒绿花白干层烯/醇种篒├加拖分支群卜农兰油烯/牡松烯种篒杜松烯种篒狟·兜铃烯杂泛类种篒甿:.,:篡霎双、雪松烯猇蚢一雪松烯~V刈榫鶥狝—可发酵产生花侧柏烯、谎┧上一雪松烯、。因此,该亚家族倍半萜合成酶的功能更复杂,可能蕴含新颖的酶学催化机制。口一杜松萜烯猄生物资源图鹁平湍敢煸幢泶锩刍肪鶦中产生倍半萜分子分析表鹁平湍钢刈橐鸩栋胼化合物样品甘香烯口一花柏烯口一榄香烯口一雪松烯顺一罗汉柏烯菖蒲二烯骋籞—换费趸烀灰┫红没药烯雪松烯一口一可巴烯△辉谅惩楸栋胼葡韦得醇‘÷松烯一谎┧上簧叽蚕.。.口一毕橙茄醇换ú喟叵札松烯弧皗海弧弧甶荨ⅲひ籾甤甿.—.?.甀瘆琉唬』。::!#弧#瑌緍、一一·万方数据●论本研究利用基因挖掘策略、酿酒酵母异源表达系统、—检测和数据库检索技术对蜜环菌基因组倍半萜合成酶编码基因进行功能鉴定,成功表达个,其中多个的代谢产物为多个倍半萜分子。截至目前,国际上多个研究团队已成功通过大肠杆菌或酿酒酵母宿主系统,将斜盖菇属真菌,荧光类脐菇,凹痕粉孢革菌,褐腐菌,虎乳灵芝和柱状田头菇中部分成功表达“驯。随着分子生物学与测序技术的发展,担子菌纲中数量众多的大型真菌的基因组测序完成并公布,基因组数据分析表明目前只有很少的基因簇编码的代谢产物能够确定,而大多数基因在实验室条件下处于“沉默”状态,其所编码的天然产物“暗物质”是正待开发的巨大宝藏“。随着担子菌纲中功能鉴定的数量不断增加,作为在次级代谢过程中扮演重要角色的倍半萜合成酶在大型真菌生命过程中具有哪些生态功能些机制控制的功能进化蔷窒抻谔定的类群还是广泛分布等卮鹫庑┪侍庑枰6源量的倍半萜合成酶进行功能表征。微生物天然产物已被证明是新药发现和药物创新的源泉。作为世纪生命医学领域催动原创突破和学科融合的前沿学科,合成生物学的崛起可突破天然药物发现的瓶颈,通过设计新的生物合成途径,从而助力药物研发。因此,合成生物学技术的发展迫切需要对更多生物合成元件的挖掘、筛选和定·李岩等:蜜环菌属真菌中倍半萜合成酶多样性与功能研究—猄,￡苎金舄焊稹敕敫哳昌罱斜罱葛器罱是罱霞导寻辞等荨导导等等穤斜舞窝敬沃&誊图肎平台对酿酒酵母重组菌訠狝—和—猄为例栋胼品肿臃治;珿籬采集时问/旷’穤一—肌耆絠:!諪纱n健辏会躵簅≯号譬等暑耳耳掣:;暗嫉既灯挂籭譬:簪:≯旁。、‘齁甤甿珿狹—猄∞巧如西∞乃鲫巧∞H缥鳌耷肾辏籷∞强姗笛∞巧勋笛∞巧∞西∞西如西∞巧∞药∞巧∞笛万方数据向进化,针对特定产物倍半萜合成酶的生物信息挖掘分析和功能预测将有助于获取理想的候选合成元件。由于大多数担子菌纲真菌在遗传转化上难以操作,因此需要开发异源表达系统进行蛋白表达和化合物生物合成途径重建∞扛2捎媒湍杆拗飨赴倍半萜合成酶的生物学功能进行系统研究,可丰富倍半萜合成酶功能信息数据库及萜类化学分子库,为后续萜类的合成生物学研究提供丰富的功能元件。本研究首次利用酿酒酵母异源表达系统通过对蜜环菌属来源的倍半萜合成酶做功能研究,表明蜜环菌属来源的倍半萜合成酶多归属于亚家族Ⅳ。该类群倍半萜合成酶报道较少,属于新的类群。我们对蜜环菌来源的的研究丰富了中该亚家族倍半萜合成酶的数量。同时,—等能复合新颖,均能合成多个倍半萜分子。这也为我们后续借助代谢工程策略优化特定,为深入开展的生物学功能和催化机制的研究奠定参考文献基础。研究进展胁菀瓹死蚶#№生物资源·,,—跞瘢攀茫虑啵刍肪幕С煞旨吧锘钚:—.泄幸┰又荆甌現琖甈,,:.,,:.琖:.,,:—.,,—.,—琫,,:—甅:—.¨钔印∞呛琀琙琈甊..,,—.,—.—珻,,珻,。琈—珻甋琘琁,,:—..甀琒..,—,,——瓺琎.—:蜜环菌属真菌中倍半萜合成酶多样性与功能研究瓵緽...,,./甁瓸—·.,,.,,:,甅琖:.。,—琑,—::.,,:—..,,—瓹嗉貉钕琙甧瓺琒琫.:一琑琘甅簃甅:.。。甅現..—:——.琄琒琓——琓珻狽篴琄甀!:—.珺猻—琀.—琍,,