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高生物利用度姜黄素对肿瘤坏死因子-α致人脐静脉内皮细胞炎症损伤模型的保护作用.pdf


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。万方数据高生物利用度姜黄素对肿瘤坏死因子一***似昃猜内皮细胞炎症损伤模型的保护作用何飞燕欢裰鞠,金子恒胧缯,黄芳动脉粥样硬化,且灾代谢障碍为基础的血管疾病,病变常累及大、中动脉,同时伴有平滑肌细胞和纤维基质增生是目前引起心血管疾病的主要原因之一?。炎症在发生发展的各个阶段都具有重要作用,因此通常也被认为是一种慢性炎症性疾病∽D谄は赴是维持血管内稳态和低氧化应激的重要调节器。其可以通过分泌各种因子响应物理化学信号,进而调节血管张力、细胞黏附、血栓生成、平滑肌细胞增殖和血管壁炎症等一3中难字⒋碳た梢杂盏寄谄细胞持续激活,发生内皮细胞功能障碍,在等心血管疾病的进程中发挥重要作用姜黄素是从姜黄属中药材中提取获得的多酚类活性成分。研究∽“实其具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种作用,表现出很强的内在活性。然而,传统姜黄素水溶性低,肠道吸收相对较差,体内代谢途径广泛,经胆囊排泄迅速,口服的系统生物利用度较低∽。#现赜跋旖;素的临床应用。基于上述背景,本研究比较了纳米制姜黄素ビ肫胀ń;扑生物利用度差异,并且利用肿瘤坏死因子一吐诱导人脐静脉内皮细胞炎症,观察不同姜黄素制剂对炎症损伤的保护作用,探讨⑧在抑制内皮细胞炎症方面是否具有优势。实验动物只清洁级大鼠,周龄,体质量菩鄹靼耄河诤纤估晨司按实验动物有限公司。生产许可证号为,实验动物质量合格证号为。动物饲养于西南大学药学院实验动物中心,相对湿度%~%,室温细胞株:江苏凯基生物技术股份有限公司。药品与试剂%臗中大恒源生物科技股份有限公司;姜黄素对照品%材料~。匀恢缫构庀哒彰鳌⑧,江苏南京;幽现写蠛阍瓷锟萍脊煞萦邢薰荆幽箱鸷泄窖Э蒲г浩し舨⊙芯克漳暇R猐目的观察纳米制姜黄素与普通姜黄素%奶迥谝┪锎欢ρ卣骷疤外抗炎作用。方法分别灌胃给予/的⑧和%,观察两者在大鼠体内的药物代谢动力学参数,并计算相对生物利用度以评价⑧的制剂优势。利用肿瘤坏死因子—琓—刺激人脐静脉内皮细胞,在体外模拟炎症诱导的内皮细胞损伤模型。以关键炎症因子水平、关键炎症因子的基因表达水平及核因子抑制蛋白,/核因子—藕磐分泄丶鞍椎谋泶锼剑兰哿街纸;扑刂萍猎诓煌┡ǘ群筒煌饔檬奔湎露阅谄は赴谋护作用。结果在相同给药剂量/拢琍嘞嘟嫌贑%=;扑啬苡行б种芓碳ひ鸬哪谄は赴字ⅲ襊璧目寡仔ЧO灾T谙嗤预时间下,低浓度“/的⑧即可显著降低细胞培养上清中前列腺素、白细胞介素、白细胞介素⒌ズ讼赴骰鞍,、,其药理作用与高浓度/%相当;在相同干预浓度下,⑧在奔纯上灾档蜕鲜鲅字⒁蜃铀剑种艻/├碜饔糜隒%干预毕嗟薄=崧跴嘣诮系团ǘ取⒔隙淌间即可发挥较好的抗炎作用,这可能与其显著提升的生物利用度有关。丶蔧生物利用度;姜黄素;炎症;人脐静脉内皮细胞;核因子”型挤掷嗪臸痡..#作者简介:何飞燕,女,硕士研究生通信作者:黄芳,女,博士,教授,博士研究生导师,琀甤琓.,万方数据R号:上海源叶生物技术有限公司;盐酸小檗碱对照品—:成都普思生物技术有限公司;批号好拦鶳公一氧化氮琋荧光探针:碧云天生物技术研究抗体:美国司;磷酸化抗体、微管蛋白籺固批号:美国公司;核因子一种琁抗体、磷酸化琾固:北京博奥森生物技术有限公司。仪器多功能荧光酶标仪:美国公司;化学发光成像仪:上海天能科技有限公司;实时荧光定量牵好拦鶥:美国公司;籗天平:梅特勒·托利多仪器有限公司。⑧的制备⑧以植物来源的多糖类物质为壁材,在液体状态下通过高剪切乳化分散媒;扑鼐细微化之后被壁材紧密包裹;之后采用超高压均质技术,使姜黄素晶体被壁材重复包裹,形成的“姜黄多糖”纳米复合物;最后采用“二次微囊干燥”工艺,以淀粉或糊精等为包裹壁材,对“姜黄多糖”纳米复合物进行二次包裹,干燥后形成水溶性良好的姜黄素微囊粉。%在大鼠体内的药物代谢动力学比较取大鼠只,随机分为两组,雌雄各半。分别灌胃给予%。分别在灌胃前眶取血。至抗凝管,频醚=R匝嗡嵝¢藜钗D诒辏宜嵋阴ポ取处理血浆样品后,采用瓹血浆中姜黄素含量,采用绘制时问曲线,,如!#琭。。,:精密称取姜黄素对照品,,甲醇定容至,得浓度为痬闹敢海儆眉状枷样品的预处理方法取空白血浆加入盐酸小檗碱内标溶液肚煸龋右宜嵋阴,涡旋混合分离上清液;下层沉淀重复上述操作,合并蔚纳清液,真空干燥。残渣加癓甲醇复溶,㈡軱滤膜过滤,待测。/分析条件色谱条件:—色谱柱;流动相为%甲酸水溶液相#痳恢℃;进样量。梯度洗脱~质谱条件:胱釉矗徽胱幽J剑焕胱釉次露﨏;脱气流速痟;锥孔体积流量流速培养采用含%血清培养基培养,于%号嘌箱中孵育。倒置显微镜观察,细胞生长至约%时传代。?觳釮盍将生长良好的以每毫升个密度接种于孔板中,每孔嘌笃ヅ嘌骸7直%无血清培养基,蟛舛靠孜光度值,评价姜黄素对活力的影响。实验平行重复巍盏糎字⒛P虷炎症模型的建立参照文献=ち己玫接种于孔板中,细胞贴壁后弃去培养液,加入含煌/奈扪G迮嘌嘌盏糎字⒛P汀炎症模型中募觳细胞接种方法同“”项。将贴壁的细胞分为椋瞻组、模型组外,向给药组分别加入含不同终浓度的培养基预保护偌尤隩/.P透粗D型复制完成后加入ü馓秸耄姹芄夥跤C副暌鞘凳奔觳庥ü馇慷!RJ笛槠叫兄馗次。司;狥所;核因子一公蛋白号公司;液质联用系统方法痬、⑧和/的和灌胃后、、.、、痬离心/测定大鼠血药浓度.,得释,配制浓度为/.的内标对照品溶液。%甲酸乙***溶液相魉...,%~;~%%~%~痟;毛细管电压的加入含不同终浓度的⑧以及、、/以及%、疞://.×,。,.琋..万方数据.?觳夤丶字⒁蜃拥暮给药及模型复制方法同“”项。模型复制笫占赴嘌锨澹肿昂蠓胖迷谝冰箱保存备用。另将细胞接种于孔板,向给药组中分别加入含相同终浓度的⑧培养基预保护偌尤隩模型复制。于模型复制后不同时间点收集细胞培养上清,收集方法及储存条件同前。按说明书要求,对上清中关键炎症因子前列腺素,紫赴樗琁、。单核细胞趋化蛋白琈~的含量进行检测。实验平行重复巍实时定量觳夤丶字⒁蜃踊费鹾厦表达水平给药及模型复制方法同“”项。模型复制笫占赴蕴崛。以肚D转录反应体系进行逆转录后进行实时荧光定量7从μ跫嬖け湫姹湫延伸R镄蛄屑表J笛槠叫兄馗次。法检测~。约梁薪械鞍锥浚琒—进行电泳分离并电转到膜,封闭’跤齪、豢构梗次日于室温孵育对应二抗茨ず蠹尤隕。发光液显影成像。。实验数据以“均数±标准差±”进行统计学描述。多组间均数比较采用单因素方差分析。硎静钜煊型臣蒲б庖濉两种姜黄素制剂在大鼠体内的药物代谢动力学参数比较大鼠灌胃给予血药浓度即达到峰值;灌胃给予⑧后,谘R┡ǘ却锏椒逯怠。表明,。见图⒈。坚姜黄素对活力的影响两种姜黄素制剂孵育螅肚疘。组比较,∮豰/N=黄素的最高给药浓度。见图相同给药时间、不同给药浓度两种姜黄素制剂的抗炎作用比较镠贜奖冉比较,,各浓度姜黄素组水平显著降低%。结果表明,姜黄素干预可显著降低猘诱导的细胞内水平,减轻内皮细胞损镠谘字⒁蜃铀奖冉空白组比较,;⑧与%的抗炎效果相当。见图各组内表达水平比较与空白组比较,模型组疘。约癈%癿/、退火结果%后,%,的生物利用度达ィ浓度一时间曲线±币与空白组伤。见图与疘.://.,表目标基因的引物序列型两种姜黄素制剂在大鼠体内的血药爿峭时/图..、万方数据:圭:圭:圭:竺兰兰生塑:蒙祭家口。岬口蠢·薰蓬一·莸┒槎::了猧—————————————干—————————傥錰弋万—一.±.:,,其中莔/表达水平的影响差异无统计学意义.<。镠趐/白表达水平比较饔肏杉活—通路,此时与空楸冉希P妥猵/皃—鞍妆泶锼骄灾,鞍妆泶锼较灾档;给予姜黄素药物干预可抑制通路激活,/%·鞍妆泶锼较灾或有升高趋势.=峁得鞲髋ǘ鹊腜/%⑧怠/注:与/1冉希不同浓度的两种姜黄素制剂对细胞存活率的影响±琻一憾组别注:;/⑧组;籱。疘—㈣组;癿。.⑧籊.。疘.%±籋.。疘。%挥肟瞻鬃楸冉希·;与模型组比较,。镠贜水平比较庖哂ü馊旧ǎ琁倍;下±一瓷号圈螅粼注:;.雖。痠。⑧组;/嘧椋籈.。疘。⑧组;。疘。癵;肛疘。%组;;与空白组比较,挥模型组比较,”镠谘字⒁蜃铀奖冉±币..±土·№籱。疘.·/’一鲁\”。,·万方数据跏兰竺专尝等‘模型玑%组;与皋白组比较,:%组;与空白组比好挥。。%~埃“”沣:た瞻鬃椋籅P团汀。『』“。疘—⑧组;弘/乓籔椋籇Ⅵ咖疞⑧组骸岳以及%均能发挥良好的抗炎作用,且疞⑧的药效较%更稳定。见图相同给药浓度、不同给药时间两种姜黄素制剂的抗炎作用比较不同时点镠谘字⒁蜃铀奖较在保肟瞻鬃楸冉希P妥镻:、。、骄灾;与模型组比较,骄灾档,在短时间内即表现出显著的抗炎作用;而%,模型组鞍妆泶锼骄灾蛋白表达水平比较保肟瞻鬃/一//琧图在懈沣:;.疘.⑧组;/.⑧组;。疘—⑧组;.%椋挥肟瞻鬃楸冉希。挥肽P妥楸冉希%图髯镠贑一一表达水平比较±币蔷能嚣皿咖弘/。椋弧#琀琽,琇⑧组;籋.。疘。模型组比较,”.图镠趇白表达水平比较±琻一一模型组比较,”镠内炎症因子水平比较纒埘一睁趔靛Ⅱ·雖/籆一~‘—猵‘“。一’。“万方数据觥鯥■■瘛鯻!瘛鰙曩●瞳—·馡●■●瘛翥孥畂●—●●●●●●瘛!.叮搿4蠓岣撸辍!C飨匝映ぁR陨弦┪锎与模型组比较,较,探究其生物利用度及体外抗炎作用。鞍妆泶锼骄灾档,本研究发现,在灌胃等剂量姜黄素的前提下,%提高%、保街纸;扑刂萍动力学参数均说明,⑧包埋在天然多糖均能显著调节上述关键蛋白的表达水平类物质中可以有效增加姜黄素的生物利用度。.=峁砻鳎谕蛔饔门ǘ仁保琍从“炎症反应”学说㈣。的提出到抗炎治疗的嘞嘟嫌贑成功实现Ⅲ珹字⒀档奶剿骶私倌晔盏嫉腘信号通路的激活。见图问。目前已经确定的发病机制中,炎症细胞单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细姜黄素具有多种药理活性,是一种具有良好开胞拖喙匮字⒁蜃如一R、返发前景的多功能药物,但是作为生物药剂学分类系激活均可以促进斑块形成,加重疾病发展的不统中的Ⅳ类药物,溶解度低、渗透性差的特点限制了稳定性:嘲。因此,本研究选用碳姜黄素的开发利用。!。除此之外,碱性环境中结构建内皮细胞炎症损伤模型,通过检测构稳定性差口?、肠道通透性低口?、存在广泛的肠道含量反映内皮细胞受损情况;通过检测关键炎症因和肝脏一级代谢。等均制约着姜黄素的临床应用。子分泌、关键炎症基因表达及通路中关键蛋为解决这一问题,目前已提出多种制剂改良策白水平来反映姜黄素给药对炎症损伤的保护作用;略”。R蕴岣呓;扑氐纳锢枚取1狙芯渴窃谝通过比较两种姜黄素制剂在不同给药浓度和不同作开发出的⑧基础上与用时问下对检测指标的影响评价体外抗炎效果。结:疞⑧组⑧的輟较%可以在较早时问抑制致%比://.:;疘。㈣组;%组;与空白组比较,挥模型组比较,.图不同时点镠趐、鞍妆泶锼奖冉繼,”。..皿猯瓸痯上岬。‘Ⅱ狪,。止Ⅱ.、万方数据增加,关键炎症因子骸、分泌增加,关键炎症基因泶锼皆黾樱通路被激活,姜黄素能有效降低炎症递质水平,抑制通路。当药物干预时问相同时,⑧在低浓度疞奔幢硐殖鱿著的抗炎效果,且其药效与%的高浓度莔/作用相当,增大给药浓度对嘁┬У奶岣呶尴灾饔茫辉诟┡ǘ认嗤保奔幢硐殖鱿灾目寡仔Ч延长干预时间对⑧药效的提高无显著值得注意的是,在相同给药时间、不同给药浓度的抗炎作用实验中,两种姜黄素制剂的浓度设计并不完全对应,这一方面是由于在摸索给药浓度的预实验中,;另一方面,从正式实验的定量结果中可以看到,疘.┖蟪灾档虸水平之外,对其他炎症因子及关键炎症基因的抑制作用并不显著,对通路中关键蛋白表达也不存在显著的调节作%体外抗炎作用仍然较差。基于上述背景,笔者认为没有必要设置低浓%组别,并在最终的实验中取消了这两个组别。综上所述,⑧通过降低姜黄素粒径提高了姜黄素水溶性,显著改善了其生物利用度。体外抗炎实验结果表明,⑧才嫌贑—%具有初始起效浓度低、初始起效时间早等优势,这可能与制剂改良后显著提高的生物利用度有关。本研究为⑧的临床开发与应用提供了参考。果表明,碳ず螅琀蠳看蠓⑧在作用。/的%%用,即/度..://.:..甆琖『瓸琈琁。.崔明花,付二花,林贞花,├硌г又荆:.,王晨林,工玉欣,┬乱┯肓俅惨├恚陈莉,范晓迪,史大卓,⒎从的实验研究辛揭浇岷闲哪匝9懿≡又荆黄雨亭,沈帅,蒋鹏飞,,,,,.,琄琒.:瓹—,琤,琂.—————:。..。。,:—,::瑀,猯:琀猣万方数据一仅一琎://.,孟永春,付丽,/...珿甇甆珽~琓.:琀甁崭迦掌冢珻琎琂,,%甅痥痭/,㈣㈣..%雖/.。㈣/—,籆籌籋,:珹.:,,..,琀,.珻,————!⑧㈣%,瑁瓾甊%.㈣,琲瓹,籒..琫:.,琑:—..甌—埃琣,琣

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