生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制公示稿.pdf

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病毒检测的豚鼠接种法也可检测分枝杆菌,按表2所列方法进行试验和观察。豚鼠在注射前应观察4周,结核菌素试验为阴性者方可用于试验,观察期末应进行结核菌素试验,并剖检观察主要脏器是否有结节形成。结核菌素试验为阴性,主要脏器无结节,则为符合要求。也可采用经过验证的分枝杆菌核酸检测法替代培养法。,依法进行支原体检查(通则3301),应符合规定。如为昆虫细胞,或细胞培养过程中使用了植物源性材料,应进行螺原体检查,所用方法如培养法或核酸法应能检测中间原体属和虫原体属。、外源病毒因子检查70007:..应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒,以及由于使用的原材料或操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法,须对根据细胞的种属来源、组织来源、细胞特性、建株及传代历史、培养方法和及过程等进行风险评估后确定。如MCB进行了全面检定,WCB需检测的外源病毒种类可主要考虑从MCB到WCB传代过程中可能引入的病毒,而仅存在于MCB建库前的病毒可不再重复检测。(1)细胞形态观察及血吸附试验取混合瓶细胞样品,接种至少6个细胞培养瓶或培养皿,待细胞长成单层或至一定数量后换维持液,持续培养两周。如有必要,可以适当换液。逐日镜检细胞,细胞应保持正常形态特征。如为贴壁细胞或半贴壁细胞,细胞至少培养14天后,分别取1/3细胞培养瓶或培养皿,%~%豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。一半加入红细胞后置2~8℃作用30分钟,一半置20~25℃作用30分钟,分别进行镜检,观察红细胞吸附情况,结果应为阴性。新鲜红细胞在2~8℃保存不得超过7天,且溶液中不应含有钙或镁离子。(21)体外不同指示细胞接种培养法检测病毒因子用待检细胞培养上清制备活细胞或细胞裂解物作为待测样本,分别接种至少下列三种单层指示细胞,包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属、同组织类型来源的细胞。对于昆虫细胞,还应至少增加两种敏感的指示细胞进行检测,一种为对虫媒病毒易感的蚊子细胞,也可使用BHK21细胞。另一种为对多种昆虫病毒易感的细胞,如果蝇胚胎来源细胞。细胞裂解物应采用细胞悬液或用培养细胞后的上清重悬细胞样本制备。待测样本检测前,可于-70℃或以下保存。77每种单层指示细胞至少接种10个活细胞或相当于10个活细胞的裂解物。接种量应占维持液的1/4以上,每种指示细胞至少接种2瓶。取培养7天的细胞各1瓶,取上清液或细胞裂解物再分别接种于新鲜制备的相应的指示细胞盲传一代,与初次接种的另一瓶细胞继续培养7天,接种细胞后应至少培养28天,期间可至少传代一次,可将细胞培养物裂解后再接种于新鲜制备的指示细胞,或直接传代。观察细胞病变,并在观察期末取细胞培养物进行血吸附试验;取细胞培养上清液进行红细胞凝集试验。80008:..%~%豚鼠红细胞、和鸡红细胞悬液或混合红细胞悬液混合悬液进行血吸附试验和红细胞凝集试验。将混合红细胞悬液加入细胞培养容器瓶,一半置于2~8℃孵育30分钟,一半置于20~25℃孵育30分钟,分别进行镜检,观察红细胞吸附情况。取细胞上清液从原倍起进行倍比稀释后,加入混合红细胞,先置2~8℃孵育30分钟,然后置于20~25℃孵育30分钟,分别观察红细胞凝集情况。新鲜红细胞在2~8℃保存不得超过7天,且溶液中不应含有钙、镁离子。接种的每种指示细胞不得出现细胞病变,血吸附试验及红细胞凝集试验均应为阴性。试验应设立病毒阳性对照,包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血吸附阳性对照及血凝阳性对照。如待检细胞裂解物对指示单层细胞有干扰,则应排除干扰因素。若已知待检细胞可支持人或猴巨细胞病毒(CMV)的生长,则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天,应无细胞病变,且血吸附试验及红细胞凝集试验应均为阴性。(32)动物体内接种法检测外源病毒因子用待检细胞培养上清液制备活细胞(或适宜时采用相当量的细胞裂解物),接种动物体内进行外源病毒因子检测。待检细胞至少应接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚(两组不同日龄)共计4组,如为新建细胞,还需接种豚鼠。原代猴肾细胞还需用家兔体内接种法或兔肾细胞培养法检查猴疱疹B病毒。按表2所列方法进行试验和观察。接种后24小时内动物死亡超过20%,试验无效。表2动物体内接种法检测外源病毒因子动物组要求数量接种途径细胞浓度接种细胞液量观察天数(个活细胞/(ml/只)ml)乳鼠24小时内至少20只脑内>1×(2窝)~20g至少10只脑内>×①9~11日龄10枚①~4天尿囊腔>5×10鸡胚5~7日龄10枚卵黄囊>2×~500g5只腹腔>4×,~>2×②×10①经尿囊腔接种的鸡胚,在观察末期,应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集试验。①每只家兔于皮内注射10处,。90009:..观察期内,如被接种动物出现异常或疾病应进行原因分析,观察期内死亡的动物应进行大体解剖观察及组织学检查,以确定死亡原因。如动物显示有病毒感染,则应采用培养法或分子生物学方法对病毒进行鉴定(。如观察期内超过20%的动物出现死亡,且可明确判定为因动物撕咬所致),试验判定为无效,应重试。观察期末时,符合下列条件判为合格。①乳鼠和成年小鼠接种组至少应有80%接种动物健存,且小鼠未显示有可传播性因子或其他病毒感染。②鸡胚接种组卵黄囊接种的鸡胚至少应有80%存活,且未显示有病毒感染;尿囊腔接种的鸡胚至少应有80%存活,且尿囊液红细胞凝集试验为阴性。③豚鼠接种组至少应有80%接种动物健存,且动物未显示有可传播性因子或其他病毒感染。④家兔接种组至少应有80%接种动物健存,且动物未显示有可传播性因子或其他病毒感染(包括接种部分损伤)。(43)逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测可采用下列方法对待检细胞进行逆转录病毒的检测。①逆转录酶活性测定采用敏感的方法,如产物增强的逆转录酶活性测定法(PERT或PBRT法)(本通则附录1或其它适宜的方法,但灵敏度不得低于现行方法),但由于细胞中某些成份也具有逆转录酶活性;,因此,逆转录酶阳性的细胞,应进一步确认是否存在感染性逆转录病毒。除已知产生逆转录病毒的细胞外,均应进行逆转录酶活性测定。②透射电镜检查法7取至少1×10个活细胞采用超薄切片法对至少200个活细胞进行透射电镜检查观察。③PCR法或其他特异性体外法根据细胞的种属特异性,在逆转录酶活性结果不明确或不能采用逆转录酶活性测定时,可采用种属特异性的逆转录病毒检测法,如逆转录病毒PCR法、免疫荧光法、ELISA法等,逆转录病毒的定量PCR法还可用于逆转录病毒颗粒的定量。④感染性试验将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞,培养后检测。根据待检细胞的种属来源,须使用不同的或多种的敏感细胞进行逆转录病毒感染性试验。100010:..如Musdunni细胞用于鼠逆转录病毒的检测,SC-1细胞用于亲嗜性逆转录病毒的检测,人源细胞系用于昆虫逆转录病毒的检测等。终点检测方法可选择PERT+-试验、SL实验或XC空斑试验等。上述不同的方法具有不同的检测特性,逆转录酶活性提示可能有逆转录病毒存在,透射电镜检查及特异性PCR法可证明是否有病毒性颗粒存在并进行定量,感染性试验可证明是否有感染性的逆转录病毒颗粒存在,因此应采用不同的方法联合检测。若细胞逆转录酶活性检测为阳性,则需进行透射电镜检查或PCR法及感染性试验,以确证是否存在逆转录病毒颗粒及是否具有感染性逆转录病毒颗粒。可产生感染性逆转录病毒颗粒,且下游工艺不能证明病毒被清除的细胞基质不得用于生产。已知产生逆转录病毒的细胞,如啮齿类动物来源的细胞、昆虫细胞及禽源性细胞,可不进行逆转录酶活性检测,但应进行逆转录病毒颗粒的类型、数量及感染性的检查。对于已有丰富先验知识的细胞系,如CHO、NS0、Sp2/0、Vero等,不需要进行化学诱导试验。对于新的细胞基质,采用化学诱导试验有助于评估细胞中是否存在未知的可被诱导的内源性逆转录病毒。对潜在的DNA病毒(如人源细胞中的疱疹病毒)和RNA病毒(如昆虫细胞中的诺达病毒),基于风险评估结果,也可使用化学诱导试验进行检测。含有逆转录病毒序列,常可产生缺陷型逆转录病毒颗粒,逆转录病毒活性为阳性,对这类细胞进行逆转录病毒检测时,可直接检测细胞基质中是否存在外源性逆转录病毒污染,如禽白血病病毒、禽网状内皮病肿瘤病毒、感染性内源性逆转录病毒。在某些情况下,也可通过监测鸡群,以保证无上述感染性逆转录病毒污染。小鼠及其他啮齿类动物来源的细胞系含有逆转录病毒基因序列,可能会表达内源性逆转录病毒颗粒,因此,对于这类细胞系,应进行感染性试验,以确定所表达的逆转录病毒是否具有感染性。对于特定啮齿类细胞(如CHO、BHK-21、NS0和sp2/0)或昆虫细胞,还应确定其收获液中病毒颗粒的量及其是否具有感染性逆转录病毒,并应在生产工艺中增加病毒去除和(或)灭活工艺。仅有高度纯化且可证明终产品中逆转录病毒110011:..被清除至低于现行检测方法的检测限以下时,方可使用这类细胞。(54)种属特异性外源病毒因子的检测应根据细胞系/株种属来源、组织来源及供体健康状况等确定检测病毒的种类。若在MCB或WCB中未检测到种属特异性病毒,后续过程中如无引入风险,不再进行重复检测。鼠源的细胞系,可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验(MAP、RAP及HAP)或经验证的分子生物学方法检测其种属特异性病毒。人源的细胞系/株,应考虑检测如人肝炎病毒(HAV、HBV、HCV)、人逆转录病毒(HIV-1/2、HTLV-1/2)、人细小病毒B19、人乳头瘤病毒、人多瘤病毒、人腺病毒、人EB病毒、人巨细胞病毒(HCMV)和人疱疹病毒-6/7/8等。人EB病毒、人巨细胞病毒(HCMV)、人逆转录病毒(HIV-1/2、HTLV-1/2)、人肝炎病毒(HAV、HBV、HCV)、人细小病毒B19、人乳头瘤病毒、人多瘤病毒、难培养的人腺病毒和人疱疹病毒-6/7/8等。猴源细胞系/株应考虑检测猴多瘤病毒(如SV40)、猴泡沫病毒(SFV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录病毒(SRV)、猴T细胞嗜淋巴病毒(STLV)等。昆虫细胞系,应考虑检测已报告污染的特定病毒(如诺达病毒),或可能持续存在于昆虫细胞系中并已知对人类具有传染性的病毒。这类病毒的检测可采用适当的体外检测技术,如分子检测技术,但所用方法应具有足够的灵敏度,以保证制品的安全。(65)牛源性病毒检测若在生产者建库之前,细胞基质在建立或传代历史中使用了牛源性材料,如牛血清或牛胰酶,则所建立的MCB或WCB和(或)生产终末细胞至少应按照通则3604的要求检测一次牛源性病毒。取待检细胞用培养上清液制备成至少相当于710个活细胞/ml的裂解物,进行检测。如果在后续生产过程中不再使用牛血清,且MCB和(或)EOPC检测显示无牛源性病毒污染,则后续工艺中可不再重复进行此项检测。(76)猪源性病毒的检测如果在生产者建细胞库之前,细胞基质在建立或传代历史中使用了猪源性材料,如猪胰酶,则所建立的MCB或WCB和(或)超过生产限定水平的细胞至少应120012:..检测一次与胰酶来源动物相关的外源性病毒,如包括猪细小病毒和猪圆环病毒或牛细小病毒等。如在后续生产过程中不再使用胰酶,且MCB和(或)EOPC检测结果显示无相关动物源性病毒污染,则后续工艺中可不再重复进行此项检测。如使用重组胰酶,应根据胰酶生产工艺可能引入的外源性病毒评估需要检测的病毒种类及方法。(87)其他特定病毒的检测根据细胞的特性、传代历史或生产培养工艺等确定检测病毒的种类。有些细胞仅对某些特定病毒易感,如CHO细胞可污染鼠细小病毒,采用上述检测方法无法检出,因此需要采用特定的方法检测,如特定感染试验或分子生物学方法对CHO细胞进行鼠细小病毒污染的检测等。(8)分子生物学方法分子生物学方法包括核酸扩增(NAT)法和二代测序(NGS)法。NAT法,如PCR法,可用于特定的病毒检测。NGS法适用于广谱和特定的病毒检测。基于风险评估结果,广谱的NGS法可用于替代体内法,也可用于补充或替代体外法(如缺少病毒易感细胞或样品对检测存在干扰或毒性)。基于体内法和体外法在病毒检测种类上的局限性以及动物使用的3R原则,不建议将NGS法与体内法或体外法进行头-对-头的比较。应使用合适的参考物质对NGS法进行方法验证或确认。病毒标准物质应由不同特性的病毒组成,包括不同物理特性(大小,有/无包膜)、不同化学特性(低、中和高抗性)及不同基因组特性(DNA或RNA,双链或单链,线性或环状)。NGS的验证或确认应支持其预期用途,当作为替代方法时,包括方法验证及样本适用性确认。当作为补充方法时,包括方法的确认和样本适用性确认。方法验证参数至少应包括专属性、病毒检测范围及灵敏度,并预先设定可接受标准。对NGS阳性结果应进一步确认检测到的核酸是否与感染性病毒相关。,是对细胞特性的鉴定。新建细胞系/株及新型细胞基质应进行成瘤性检查。某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有成瘤性,而超过一定代次则具有成瘤性,如Vero细胞,因此必须进行成瘤性检查。130013:..用于疫苗生产的细胞系/株应进行成瘤性检查,但当未经遗传修饰的二倍体细胞被证明无成瘤性后,可不作为常规检查要求。已证明具有成瘤性的传代细胞,如BHK21、CHO、HEK293、C127、NSO细胞等,或细胞类型属成瘤性细胞,如杂交瘤细胞,用于生产治疗性制品时可不再做成瘤性检查。昆虫细胞或禽源细胞进行体内成瘤性检查时,需评估方法的适用性,如细胞生长温度是否与哺乳动物物种的体温相适应。成瘤性检查的方法见本通则附录2。具有成瘤性的新建细胞或新型细胞基质,需采用定量的方法进一步分析细胞成瘤性的大小,并计算该细胞的半数致瘤量(TPD50),并根据生产工艺及制品的特性,评估成瘤性的风险。体内法是成瘤性评价的标准,但对于某些细胞,也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测细胞的成瘤性,特别是对于低代次、在动物体内无成瘤性的传代细胞系。体外法的结果可作为细胞成瘤性评价的参考。7、致瘤性检查:致瘤性检查是保证细胞基质中不存在可使细胞永生化或诱导肿瘤形成并具有形成肿瘤的因子。细胞基质致瘤性可能与细胞DNA(或其它细胞成份)或细胞基质中含有致瘤性因子相关。来源于肿瘤的细胞或因未知机制形成肿瘤表型的细胞,含有致瘤性物质的理论风险性相对较高。已建株的二倍体细胞,如MRC-5、2BS、KMB17、WI-38及FRhL-2新建主细胞库不要求进行致瘤性检查。已建株的或有充分应用经验的连续传代细胞,如CHO,、NS0、Sp2/0、低代次的Vero细胞不要求进行致瘤性检查。新型细胞基质,特别是成瘤性为阳性的细胞,用于疫苗生产时,需进行致瘤性检查。可采用待测细胞裂解物和(或)细胞DNA按照本通则附录3的方法进行致瘤性检查。如根据细胞基质的表型或来源疑似有致瘤性病毒,建议用细胞基质裂解物接种动物进行致瘤性检查;若细胞基质具有成瘤性表型,建议用细胞DNA接种动物进行致瘤