附4药包材细胞毒性试验方法.pdf

该【附4药包材细胞毒性试验方法 】是由【fwang2】上传分享，文档一共【5】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【附4药包材细胞毒性试验方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。2024年2月1附42药包材细胞毒性试验方法3本法系将供试品或供试品溶液接触细胞,通过对细胞形态、增殖和抑制影响4的观察,评价供试品对体外细胞的毒性作用。5试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。试验时采用传代48~72小6时生长旺盛的细胞。7试验前的准备与样品及细胞接触的所有器具均需无菌。必要时可采用湿热8灭菌,如115℃保持30分钟;干热灭菌,如250℃保持30分钟或用180℃保持92小时。10供试品溶液的制备取供试品,按照“药包材生物学评价与试验选择指导原11则(9651)”中生物学试验的要求制备供试品溶液。12第一法相对增殖度法13阴性对照液制备为不加供试品的细胞培养液。14阳性对照液制备取阳性参比物,按照供试品溶液的制备项下的规定进行,%苯酚的细胞培养液。16试验方法取33个培养瓶,分别加入4×104个/mL浓度的细胞悬液1mL,17细胞培养液4mL,在37℃±1℃,5%±1%CO2的条件下培养24小时。培养24小时18后弃去原培养液。19阴性对照组:取13个培养瓶分别加入5mL阴性对照液;20阳性对照组:取10个培养瓶分别加入5mL阳性对照液。21供试品组:取10个培养瓶分别加入5mL含50%供试品溶液的细胞培养液,22在37℃±1℃,5%±1%CO2条件下继续培养7天。00012024年2月23细胞形态学观察和计数:在更换细胞培养液的当天,取3瓶阴性对照组,并24在更换后第2、4、7天,每组各取3瓶进行细胞形态观察和细胞计数。25毒性评定细胞形态分析标准按表1规定进行。26细胞相对增殖度分级标准按表2规定进行。27表1细胞形态分析表反应程度细胞形态无毒细胞形态正常,贴壁生长良好,细胞呈棱形或不规则三角形轻微毒细胞贴壁生长好,但可见少数细胞圆缩,偶见悬浮死细胞中度毒细胞贴壁生长不佳,细胞圆缩较多,达1/3以上,见悬浮死细胞重度毒细胞基本不贴壁,90%以上呈悬浮死细胞28表2细胞相对增殖度分级表分级相对增殖度)(%)0≥100175~99250~74325~4941~245029根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度(RGR)。供试品组(或阳性对照组)细胞浓度平均值30RGR??100%阴性对照组细胞浓度平均值31结果评价供试品组相对增殖度(以第7天的细胞浓度计算)为0级或132级判为合格。试验组相对增殖度为2级,应结合形态综合评价,轻微毒或无毒的33判为合格。试验组相对增殖度为3~5级判为不合格。34第二法琼脂扩散法35本法适用于弹性体细胞毒性的测定。当聚合物供试品中可滤取的化学物质扩00022024年2月36散时,琼脂层可起到隔垫的作用保护细胞免受机械损伤。供试品溶液将通过一张37滤纸(表面积不小于100mm2)进行试验。38阴性对照制备取阴性参比物,例如高密度聚乙烯,按照供试品溶液的制备39项下的规定进行。40阳性对照制备取阳性参比物,例如二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯41(ZDEC),按照供试品溶液的制备项下的规定进行。可采用10%二***亚砜42(DMSO)溶液,附着到生物惰性吸收性(例如超细硼硅玻璃纤维滤纸)的基质43上。44试验方法取细胞悬浮液(1×105个/mL)7mL,均匀分散至直径60mm的培45养皿中。置于37℃±1℃,含5%±1%CO2气体的细胞培养箱中培养24小时至近汇46合单层细胞,弃去培养皿中培养基,将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的472倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合,使琼脂最终质量浓度不大于2%,在每只培养48皿内加入新制备的含琼脂培养基(要足够薄以利于可沥滤物的扩散)。49含琼脂培养基凝固后,可用适当的染色方法染色。将供试品、阴性对照、阳50性对照小心地放在培养皿的固化琼脂层表面。51每个供试品、阴性对照、阳性对照试样间尽量保持合适的距离并远离培养皿52壁,每一培养皿中放置不超过3个试样,每个试样至少设置2个平行。置5337℃±1℃,5%±1%CO2的细胞培养箱中至少培养24小时±2小时。用显微镜观察54每个供试品、阴性对照、阳性对照试样反应区域。用活体染料,如中性红有助于55检测细胞毒性。56结果评价按表3进行细胞毒性评价和分级。如阴性对照为0级(无毒)、57阳性对照不小于3级(中度毒),则细胞培养试验系统有效。-(轻度毒)时,则判为合60格。61第三法直接接触法62供试品制备采用供试品的平整部分,表面积不小于100mm2。63阴性对照制备取阴性参比物,例如高密度聚乙烯,按与供试品相同方式制64备。65阳性对照制备取阳性参比物,与供试品相同方式制备。66试验方法取生长旺盛的细胞悬浮液(1×105个/mL)2mL,置直径35mm的67平皿中培养单层细胞。置于细胞培养箱中培养24小时至近汇合单层细胞,吸去68培养基,。69在每个培养皿中单独放置1个供试品、阳性对照或阴性对照,每个试样70至少设置2个平行。将所有的培养物置37℃±1℃含5%±1%CO2的细胞培养71箱中至少培养24小时,培养箱宜保持适当的湿度。显微镜下观察每个供试72品、阴性对照、阳性对照周围,必要时应进行染色。73结果评价按照琼脂扩散法结果评价项下的规定进行。若样品不超过2级(轻74度毒),则样品判为合格。若试验系统无效需重复试验过程。75第四法浸提法00042024年2月76阴性对照制备取阴性参比物,例如高密度聚乙烯,按照供试品溶液的制备77项下的规定进行。78阳性对照制备取阳性参比物,按照供试品溶液的制备项下的规定进行79试验方法取生长旺盛的细胞悬浮液(1×105个/mL)2mL,置直径35mm80的平皿中培养单层细胞。培养不少于24小时至细胞至少达到80%近汇合后,吸81去培养基,替换为供试品溶液、阴性对照液或阳性对照液。含血清培养基提取液82和不含血清培养基提取液无需稀释,平行试验2份。%***化钠注射液为介质的83提取液用含血清的细胞培养基稀释至提取液浓度为25%,平行试验2份。所有的84培养物在37℃±1℃,含5%±1%CO2的培养箱中培养48小时。48小时后,在显微85镜下观察培养物,如有必要,进行染色。86结果评价按表4进行毒性评价和分级。若试验系统不成立,重复试验。供87试品不超过2级(轻度毒),则判为合格。如需进行剂量-反应程度评价,可通过88定量稀释样品提取液,重复试验。89表4浸提法毒性分级分级毒性毒性区域的描述0无毒胞内颗粒明显,无细胞溶解圆缩、贴壁不佳及无胞内颗粒的细胞不超过20%,偶1极轻微见悬浮死细胞圆缩细胞及胞内颗粒溶解的细胞不超过50%,无严重2轻微毒的细胞溶解现象,细胞间无较大空隙3中度毒圆缩或溶解的细胞不超过70%4严重毒几乎所有细胞坏死900005